细胞色素b5（Cytochrome b5）含量测定试剂盒使用说明书

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。细胞色素P450和细胞色素b5是P450酶系的两个血红素蛋白，其比值的变化与P450代谢活性密切相关。

测定原理：
氧化型细胞色素b5经连二亚硫酸钠还原后，在424nm处有最大吸收峰，通过测定424nm和490nm处吸光值的差异，即可计算出细胞色素b5的含量。
 
自备仪器和用品：
可见分光光度计、普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
 
试剂组成和配制：
试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加100mL蒸馏水，充分溶解。
试剂二：液体×1瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；
 
工作液配制：临用前配制，戴一次性手套，小心打开试剂三瓶盖，加试剂二50 mL充分溶解，4℃避光可保存1周。

样品中细胞色素b5提取：
1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加入1mL试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4℃离心30min，取上清液，转入超速离心管中。
2、粗制微粒体：100 000g，4℃离心60min，弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min，弃上清液。
4、待测液：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL，盖紧后充分震荡溶解，即待测液，该待测液需当天测定。
 
细胞色素b5含量测定操作：
1. 分光光度计预热30 min。
2. 工作液置于25℃水浴中预热30 min。
3. 空白管：取1mL玻璃比色皿，加入50 μ L蒸馏水，1000μ L工作液，室温静置2 min，424nm和490nm处吸光值，424nm处吸光值记为A空白管1，490nm处吸光值记为A空白管2。△A空白管= A空白管1- A空白管2
4. 测定管：取1mL玻璃比色皿，加入50 μ L待测液，1000μ L工作液，室温静置2 min，424nm和490nm处吸光值，424nm处吸光值记为A测定管1，490nm处吸光值记为A测定管2。△A测定管= A测定管1- A测定管2。
注意：只需要做一个空白管。
 
样品细胞色素b5含量计算公式：
(1).按照蛋白浓度计算:
细胞色素b5含量(nmol/mg prot)= (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总÷（Cpr×V样）
                           = 123×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr
(2).按照样本质量计算:
细胞色素b5含量（nmol/g 鲜重）= (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×（V样总÷V样）÷W
= 61.4×(△A测定管-△A空白管)÷W
ε：还原型细胞色素b5纳摩尔消光系数，171×10^-6 L/nmol/cm；d：比色皿光径（cm），1cm； V反总：反应体系总体积，1.05 m L=0.00105 L；Cpr：待测液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V样：加入反应体系中待测液体积，50 μ L=0.05 mL；V样总：待测液总体积，0.5 mL；W：样品质量，g。