实时荧光定量PCR技术原理及检测方法

荧光定量PCR（qPCR）是通过荧光染料或荧光标记的具有特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，可以实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度，也被称为实时荧光定量PCR。
定义注意点：
1. 荧光定量PCR是采用荧光染料或者是荧光探针进行标记跟踪。也就是说荧光定量PCR可以采用染料法和探针法。染料法和探针法之间也有较大的区别，在选择时需要注意。
2.荧光定量PCR可以测定样本模板的初始浓度，也就是可以定量。这一点比普通PCR有较大优势，大多数时候我们需要知道的是初始浓度，而不是普通PCR的产物浓度。

原理：
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

检测方法：

1.SYBRGreenⅠ法:

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

SYBR定量PCR扩增荧光曲线图

PCR产物熔解曲线图(单一峰图表明PCR扩增产物的单一性)

2.TaqMan探针法:

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。