FITC标记反应原理

FITC标记反应原理：
        蛋白质分子的赖氨酸残基的游离氨基可与FITC发生亲核反应，形成硫脲连接而共价结合。
 操作过程：
实验前准备：

1.   仔细阅读使用说明书。
2.   计算待使用FITC的量。
3.   提前20 min从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温（注：不需要用到的FITC继续放置冰箱中）。
4.   溶解FITC：加入30 μL DMF至FITC瓶中，静置10 min，待其充分溶解，此时FITC的浓度为10 mg/mL。

操作步骤：（本操作步骤按照1 mg的量进行标记）

1.   取1 mg待标记抗体于Filtration tube中，并加入相应体积的 Labeling Buffer至总体积为0.5 mL，12,000× g离心10 min。（注：①Filtration tube的最大体积为0.5 mL。 ②待标记抗体浓度低时，可先超滤离心一次。）
2.   加入15 μL FITC 和适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使抗体的终浓度为2 mg/mL，并轻轻吹打混匀。放入37 ℃恒温箱中避光温育60 min。
3.   12,000× g离心10 min。
4.   加入适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使终体积为0.5 mL，并轻轻吹打混匀，12,000× g离心10 min。并重复操作一次。
5.   加0.2 mL Labeling Buffer至Filtration tube中，轻轻吹打。将滤芯倒转放置于另一个离心管中，6,000× g离心10 min。
6.   收集离心管中的溶液，即为FITC标记的抗体。

注意事项：

1.   本试剂盒也可标记其它含有氨基（NH2-）的抗原、HRP、多肽，具体标记比例根据待标记物中氨基的数量确定。
2.   DMF要密封干燥保存，使用完立即用封口膜封紧。
3.   操作步骤5中，可用Labeling Buffer作为回收标记抗体的缓冲液，也可使用其它任何缓冲液或保护剂。
4.   本试剂盒未开封前的有效期为一年，请在有效期内使用。
5.   本试剂盒提供的为10 kDa的Filtration tube，标记抗原或多肽请注意分子量的大小。
6.   在步骤2中，标记其它抗体时，我们应先控制抗体的终浓度为2 mg/mL，然后再根据抗体的量计算应加入FITC的体积。
7.   要确定在偶联中不引入游离氨基（Tris,氨及叠氮钠均可与FITC反应，因此会降低蛋白与FITC的偶联率）