免疫印迹实验相关原理介绍

免疫印迹(Western blot)简介和原理

        免疫印迹用于鉴定能够与特异性抗体相互作用的大分子抗原（一般为蛋白质）并测定抗原的大小。蛋白质首先通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再通过电泳转移到固相支持物上，固相支持物包括硝酸纤维素膜，聚偏乙烯二氟（PVDF）膜和阳离子尼龙膜等。首先把膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸附，这样固定的蛋白即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用。最后通过放射，生色或化学发光的方法进行定位。

实验常规试剂

1.  1.0 mol/L Tris•HCl （pH6.8）

2.  1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8）

3.  10% SDS

4.  10% 过硫酸胺（AP）

7.  还原型 5XSDS 上样缓冲液

8.  10X电泳液缓冲液

9.  10X转膜缓冲液

10. 1X转膜缓冲液

11. 10XTBS缓冲液

12. 1XTBST缓冲液

13. 封闭缓冲液: 1X TBST 含5% w/v 脱脂牛奶或者1X TBST 含2%-5%的牛血清白蛋白(BSA)。

14. 一抗/二抗稀释缓冲液: 常规稀释液使用的是含5% BSA 或5%脱脂牛奶的1X TBST，见一抗/二抗说明书；每种Elabscience®抗体都有固定的最佳稀释比例。

 

操作步骤

1.     根据待测蛋白分子量大小确定凝胶（分离胶）浓度制胶

2.    上样 使用适当的裂解液以及裂解方法裂解贴壁细胞、悬浮细胞或者组织样品。

3.     跑胶： 浓缩胶推荐用 80 伏电压，待样品进入分离胶后，可用 120-180 伏。

4.     跑胶完成以后，需先将胶上无样品的多余部分切除，滤纸和海绵需要预先润湿。

5.     分离的多肽转移至膜载体上

        选择合适的膜

        转膜：以NC膜为例

        提前十分钟到半小时用转膜 Buffer 润洗 NC 膜

        按照以下的结构来安装转膜体系：负极-海绵-三层滤纸-胶-膜-两层滤纸-海绵-负极。

6.     转膜，一般为 2 小时。

7.     转完后将膜用1×丽春红染液染5 min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。 将膜晾干备用。

8.     抗原检测

        免疫印迹膜上非特异性蛋白质结合位点的封闭：

        a. 转好的膜先用 TBST 润洗两次，每次五分钟。低速水平摇床，常温。

        b. 用 5%的脱脂牛奶（TBST 配制）常温封闭一至两小时。封闭过程应在常温下置于转速较低的水平摇床。

        抗体与抗原特异性结合：一抗孵育

9-11.用 TBST 洗膜三次，每次十分钟。

12.   常温下用二抗孵育一到两个小时。

13-15. 用 TBST 洗膜三次，每次十分钟。

16.    准备 ECL 底物，对 8×5 cm 的膜，2毫升（1 毫升 A 加1 毫升 B）足够。将膜浸润底物中 1 分钟，然后取出，用滤纸吸掉膜上多余的底物。

17.    用 x-ray 底片曝光，根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1 min或5 min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。

 

Western blot常见问题分析指南

为什么电泳的条带很粗？

        电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。

        处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确(6.7）；适当降低电压；

为什么电泳电压很高而电流却很低呢？

       这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。

       处理办法：电泳槽正确装配即可。