利用光遗传方法在FLIPRT ETRA系统上对Cav1.3通道的研究

介绍

Ca_v1.3是一种L型电压门控钙通道，是药物发现的重要治疗靶点。有研究表明，一些药物对Ca_v1.3通道产生了状态依赖性的效应¹，这意味着这些药物的效应随着膜电位的变化(Vm)以及随之而来的通道状态的改变(开放、关闭、失活)而发生变化。由于这可能为病理上过度激活的Ca_v1.3通道提供了高度期望的选择性，因此，对高通量分析方法的开发需求日益增长，以评估通道阻断剂的不同状态下的效应。

目前的筛选方法采用电生理学或荧光法，利用钾离子来调节膜电位，但两种方法都有很大的局限性。电生理学直接控制Vm，但它是侵入性的且并不是很适合高通量的检测分析模式，而荧光测定法则具有较差的生理相关性，而且是不可逆的。

为了解决这些局限性，我们在这里报告了一种新的解决方案，它利用光遗传学方法通过光敏感通道-2(channelrhodopsin-2，ChR2)²来控制Vm。ChR2是一种光门控机制的非选择性阳离子通道，主要用于通透钠离子(Na+)。当通过蓝光(470nm)激活时，ChR2介导Na⁺的流入，从而延长了膜的去极化，使Ca_v1.3通道首先进入开放状态，然后逐渐进入失活状态。在光激活终止后，膜电位再极化，这将使Ca_v1.3通道回到它的静息状态。在这项研究中,我们将使用FLIPR系统展示一种光遗传学方法的新应用来控制Vm，进行可逆且精确的方式来筛选状态依赖性钙通道阻断剂。

材料

- HEK-293细胞系联合表达ChR2D156A(来源于莱茵衣藻)，人源的Ca_v1.3α1+α2δ,Β亚基，以及人源的K_ir2.3是由意大利米兰的AxxamS.p.A提供。K_ir2.3的表达首先将Vm设置为超极化值，在全反式视网膜辅因子存在的情况下，它可以对胞外高钾离子(作用于K_ir2.3)，或蓝色光刺激的ChR2进行去极化。在这两种情况下，去极化的Vm都会导致Ca_v1.3打开，允许钙进入细胞。

- FLIPR^TETRA系统(0310-5147),FLIPR^®钙6检测试剂盒(R8190)和FLIPR^®膜电位检测试剂盒(R8042)，均来自于都从Molecular Devices公司。

优势

- 通过光的应用，开发出靶向特异性和非侵入性的检测方法。
- 灵活的、可逆的检测方案
- 数据质量达到电生理以及钾离子刺激等方法检测的标准

方法

光遗传学的一个强大应用是利用光敏驱动器控制Vm。在本研究中，C.reinhardtii的光敏ChR2蛋白被用于控制Vm，作为对状态依赖性Ca_v1.3阻断剂的高通量分析检测的基础。具体地说，ChR2_D156A突变体在FLIPR Tetra系统上被其LED所发出的蓝光(470nm)激活，这使得由于其对Na⁺的渗透性和开放状态下约为6.9分钟的延长的时间常数³，导致了一种超强的且被延长的膜去极化。由于Vm的去极化，Ca_v1.3通道首先打开允许Ca²⁺离子进入细胞，(图1)，并随着时间的推移进入失活状态(图2)。使用FLIPR钙6检测试剂盒观察细胞内钙离子的动态变化。

用ChR2控制Vm

作为验证Vm控制的第一步，用FLIPR膜电位染料(Ex530nm/Em565nm)测量荧光信号的变化，这是Vm变化的结果。HEK-293细胞经ChR2、K_ir2.3、Ca_v1.3转染后，在全反式视网膜辅因子存在的情况下，按照标准流程FLIPR膜电位染料孵育。利用FLIPR^TETRA系统，利用蓝色发光二极管的光脉冲刺激ChR2通道来诱导膜去极化。第二种方案是同时进行的，它能激发膜电位染料，并随着时间的推移测量荧光发射的变化。荧光信号的增加反映了膜的去极化。在第一次蓝光刺激结束后，ChR2通道进入关闭状态，允许Vm重新极化，从而导致荧光信号随时间减少。

ChR2对Ca_v1.3的控制

HEK-293细胞经ChR2、K_ir2.3、Ca_v1.3转染后，首先在全反式视网膜辅因子存在的情况下，加入了FLIPR钙6染料进行孵育。使用FLIPR Tetra系统，细胞用蓝光脉冲刺激ChR2，而荧光的变化则通过Ca_v1.3反映钙进入细胞。在随后的实验中，使用了双脉冲刺激方案，在第一次脉冲后，第二次光脉冲在第一次脉冲后应用于失活的Ca_v1.3恢复。

高钾条件下对Ca_v1.3的调控

作为参考，在同一细胞系上进行了高钾条件下分析Ca_v1.3通道活性的标准方法。当高钾离子被添加到细胞外液中时，膜电位去极化使得Ca_v1.3通道打开，钙离子进入细胞(图1)。随着时间的推移，Ca_v1.3进入失活的非导电状态。用FLIPR钙6染料测量细胞内钙的增加。该方法要求高浓度的K+对非生理的细胞具有许多“非靶向”效应。此外，这种应用是不可逆转的，因为钾离子不能从孔板中去除。

药理学

为了验证光遗传学在药理学实验中的效用，一组实验采用了状态依赖性抑制剂依拉地平来阻断Ca_v1.3通道，并在关闭和失活状态下分析IC₅₀的结果。三种方法激活Ca_v1.3通道，包括光遗传学、基于K_ir2.3的高钾添加、和膜片钳检测方法，比较两种状态下的依拉地平的IC₅₀值。

结果

通过ChR2调控Vm

通过用FLIPR膜电位染料孵育ChR2转染的HEK-293细胞，验证了光激活ChR2对膜电位的调控。由FLIPR^TETRA系统LED发出的蓝光脉冲导致膜去极化，而FLIPR膜电位染料的信号增加了3倍(图3a)。随着时间的推移，膜电位信号的记录显示，当细胞膜重新极化时，从最初的蓝光刺激到大约30分钟后，荧光信号返回到背景水平。这一数据表明，当蓝色光刺激ChR2打开时，Vm首先被去极化，随着时间的推移，随着ChR2通道关闭Vm重新极化(图3b)，它的时间常数为6.9分钟。

ChR2诱导的Ca_v1.3反应

转染的HEK-293细胞与FLIPR钙6染料孵育。随着钙离子进入细胞(图4A)，蓝色发光二极管发出的光脉冲触发了荧光信号的增加。随后的实验(图4B)中，使用双脉冲检测方案的细胞来识别Ca_v1.3通道从失活状态恢复的时间依赖性。10分钟间隔后，记录到了原始钙流一半的信号。45分钟间隔后，几乎100%的信号被记录下来。数据显示，在第一次光脉冲10分钟后，一半的通道仍处于失活状态，从而产生50%的最大钙信号。

钾离子的调控

用K⁺调控Ca_v1.3通道的状态，转染HEK-293细胞系中加载FLIPR钙6染在37°C下孵育一小时，添加缓冲液增加钾离子浓度从4mM到75mM以形成不同的膜电位(Vm)。然后在FLIPR^TETRA系统中检测钙信号时添加75mM的高浓度K⁺。代表性的钙信号响应如图5A所示。K+依赖的失活曲线展示了与K⁺浓度对应的FLIPR钙6染料信号，数据显示诱发的50%最大Ca²⁺信号的钾离子浓度是22mM(图5B)，这表明在添加了此浓度的钾离子条件下有一半的Ca_v1.3通道处于失活状态。

药理学

依拉地平是一种抗高血压药物，它也可能有助于减缓帕金森疾病症状的发展，因其对Ca_v1.3的状态依赖性影响而被选为这项研究的对象。采用ChR2的光遗传学检测方案，表达了Ca_v1.3的HEK-293细胞在添加不同浓度依拉地平的情况下，用FLIPR钙6染料在37°C下孵育一小时。在FLIPR^TETRA系统上采用蓝色光脉冲进行刺激，检测到通道关闭状态下钙流荧光信号的强度的增加。10分钟后，给予了第二次蓝色光脉冲刺激，记录到了通道失活状态下钙流荧光信号的变化。仅观察到原始钙流信号一半强度的荧光信号。在图6A中，结果显示为Ca_v1.3通道效应的%。高K⁺调控方案记录的依拉地平的IC₅₀曲线如图6B所示。在较早的钾离子调控实验基础上，将4mMK⁺或22mMK⁺添加到FLIPR钙6染料的加载缓冲液中，分别诱导关闭和失活状态。在FLIPR^TETRA系统中检测钙信号时添加了75mMK⁺。膜片钳方法下检测的Ca_v1.3通道关闭和失活状态下依拉地平的IC₅₀曲线如图6C所示。

总结

包括膜片钳结果在内的所有Ca_v1.3通道关闭和失活状态下依拉地平的IC₅₀值得比较如表1所示。与关闭状态下的值相比，所有检测方法下得到的在失活状态下的IC₅₀值的左移大约为10倍。这很重要，因为对离子通道的复合效应在通道关闭和失活状态下可能具有不同的临床意义。通过光遗传学检测方案，IC₅₀值更接近于以电生理方法获得的IC₅₀值。光遗传学所获得的“阻断比例”值与电生理学方法所获得的值高度相似，从而提示其高生物相关性。与电生理学不同的是，光遗传学检测中的细胞在实验结束时完好无损。此外，光驱动的光遗传检测是可逆的，这是灵活的分析方法的一个非常理想的特性。

致谢

实验工作和数据数据由意大利米兰的AxxamS.p.A提供。

参考文献

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2.Prigge,M.,Rossler,A.,Heggeman,P.,Channels.2010,May/June,4:3,241-247.
3.Berndt,A.,Yizhar,O.,Gunaydin,L.,Hegemann,P.,Deisseroth,K.,NatNeurosci.2009,Feb;12(2):229-234.
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