应用原代细胞进行高通量复杂炎症分析
前言
炎症反应的一个重要步骤是细胞表面抗原与血管中免疫细胞的特异性结合。因此，对这些分子变化的及时监控，如VCAM,E-selectin，以及内皮细胞上的HLADR等等，可以为细胞水平的炎症模型提供有效的生理指标上的支持。
我们用多通道荧光读取人原代细胞表面的炎症标记，并在此基础上评估不同介质对炎症反应的调节作用。例如，在用炎症因子(TNF或者IFN)刺激原代内皮细胞(HUVEC)后，细胞表面的炎症标记表达可以通过检测与之结合的预染抗体的总荧光强度来定量。
我们在多个指标如增加组间差异，重复性和通量上对IsoCyte扫描细胞计数仪和SpectraMax®M5微孔板读板机进行了比较。多通路的读值在检验抗炎化合物的有效性和毒性的同时，还可以通过选择性抑制不同信号通路激活的炎症标记来深入的研究相关机制。
炎症实验
用炎症因子（TNF, IFN；R&D）刺激HUVEC细胞（lonza）24h。用BD 公司说明书推荐的方法，利用预染抗体和粘附分子的特异性结合对细胞进行染色标记。
选择的抗体包括：
PE-conjugated anti-CD106 (VCAM),
APC conjugated anti E selectin
APC-conjugated anti-HLA-DR
AF488-conjugated anti-CD31（PECAM）
方法
荧光检测炎症标记
演示中的IsoCyte-DL 扫描细胞计数仪 平台配置了20mW 488nm和40mW 640nm的激光器。488nm的激光器配套510-540nm的带通(bp)滤光片(Ch1)可用于检测Alexa Fluor®488(AF488)标记的细胞；Phycoerythrin标记细胞的检测则需要配560-610nm bp的滤光片(Ch3)；APC的检测需要640nm的激发和660-720nm的发射滤光片。图像的获取是通过5*5的微米采样，在5min内对96孔或者384孔板完成扫描。
SpectraMax® M5 多孔板读板机包含的488nm激发和530nm散射(二向色镜 515nm)可以检测Alexa Fluor®488标记的细胞，590nm(二向色镜550nm)可以检测Phycoerythrin标记细胞。
结果和讨论
用SpectraMax® M5 检测炎症标记的表达
抗炎化合物抑制黏附分子
潜在抗炎化合物比较
多通路炎症实验
高通量实验评估抗炎化合物效力
总结
- 我们通过检测标记抗体与粘附分子的结合，可以有效的评估抗炎化合物的效能。
- 我们已经测试了多种炎症因子和抗炎药物组合对HUVEC细胞的不同处理条件下，细胞炎症标记，如VCAM,E-selectin，HLA-DR,CD31的表达水平。
- 运用多通道的IsoCyte 或 SpectraMax® M5可以有效监测炎症标记的上调和下调。
- 我们的数据包括利用3种已知的抗炎化合物：AG126，SB202190和PDTC来评估抗炎分子的效力。
- 在高通量兼容模式下，我们可以在96孔和384孔板水平上用多通路炎症实验检验抗炎化合物的效力。
