宫内干细胞移植的新方法（先天性脊椎裂胎鼠）

1材料和方法

1.1 实验动物

雌性Wistar大鼠86只（由中国医科大学附属盛京医院动物实验室提供，合格证号：SCXK京2009-0004），在SPF级环境下饲养，合笼并阴道涂片确认孕0天，于孕10天维甲酸口服给药制备胚胎脊柱裂模型[2]。

1.2 材料和设备

维甲酸；显微镊子、显微剪刀、显微针持、6-0显微缝合线；显微注射针[1]；手术显微镜；手术加热垫；

1.3 手术方法

1.3.1 显微外科及胎仔外科

孕16天、17天、18天孕鼠，10%水合氯醛按0.32ml/100g体重腹腔麻醉后，仰卧位固定于手术加热垫上（预设38℃），肛门直肠内测温。调整手术显微镜，座椅。常规腹部消毒，腹部正中开腹，暴露双侧子宫角，术野外围铺温盐水纱布。将一侧子宫角轻轻拉出放置在纱布上，清点胚胎数量，确认胚胎头尾位置，调整胚胎子宫部位至手术显微镜视野内。

镜下确认胚胎脊柱裂部位，在对应子宫壁部位做一预置缝线荷包，逐层剪开子宫壁长约2mm，暴露羊膜，轻轻推压子宫壁，调整脊柱裂位置至清晰暴露于镜下术野，此时手术显微镜放大倍数为20倍，可以清晰见到胚胎的脊髓，滴加37℃预热温生理盐水保温保湿（图1）。

1.3.2 显微注射技术

本实验中作者使用独立吹吸显微注射法进行操作，暴露羊膜后，抽吸约2ul转染绿色荧光蛋白基因的骨髓间充质干细胞，将显微注射针移至镜下术野，迅速刺入羊膜后，轻划羊膜，使羊水外流，对准脊髓进针约2mm深。针头保持2s，缓慢后退针头并吹出干细胞，干细胞完全注入后，针头保持在组织内不动，保持注射针内压力，停止2s，减少因组织压力导致移植的干细胞外溢，之后迅速退出针头，显微注射完毕（图2）。

轻拉预先缝合在子宫壁的荷包缝线，打结缝合，检查子宫壁修复情况，必要时可以加针缝合加固(图3）。将子宫轻轻推回腹腔，并轻轻挤压腹壁，使其归位避免肠梗阻。其它胚胎相间隔做同样操作。                

图1 预置缝线荷包

                       Fig.1 Preset Suture Pouch                

图2 干细胞显微注射

                      Fig.2 Stem Cell Microinjection               

图3预置荷包打结

Fig.3 Preset pouch knot  

2结果

孕20天胚胎切片荧光显微镜下观察脊髓内可见间充质干细胞呈现绿色荧光成活胚胎数195例，干细胞成活率98.5%，（图4，图5为图4局部放大图），证明干细胞移植成活，成功。

   图4 脊髓内间充质干细胞（→） ×100 

          Fig.4  MSCs in Spinal ×100