使用冷冻分装技术提高粪便微生物菌群研究的效率和质量：突破处理粪便样本难题

作者：Graham S. Long, Joseph M. Fraone, and Larry Chin

 

 

目前，肠道微生物菌群研究已经成为科学研究领域越来越重要的一个方向，肠道微生物菌群研究在药物研发、营养学研究、疾病预防和诊断等领域有着广泛的应用价值，潜力巨大。然而，粪便样本除了物流运输这一关键步骤以外，还面临着健康和安全性的系列挑战，同时直接接触这些样本往往也是不受欢迎的操作处理方式。

 

因为粪便样本一般呈半固体状态，难以使用传统的人工或者自动化液体工作站进行操作，由于高通量操作能力的限制，所以很难将小型实验性研究升级成大型项目型研究。

  

针对以上描述的各项困难与挑战，  种新型、高效的冷冻样本分装技术为其提供了相应的解决方案。通过将粪便样本保持在冷冻状态下（温度控制在-80C或以更低水平），消除冻融循环，可以很好地保存微生物菌群的活体特征。此外，冷冻样本分装提供一种安全且一致性的样本操作方法。由于抑制了令人不悦的气味产生，帮助实验人员轻松的处理更多的粪便样本，改善了实验环境。

 

目前市面上仅有两款仪器可以用于实验室的冷冻样本分装操作。一款是桌面型半自动化仪器，可容纳并处理市面上大部分的样品管规格，适合于较小规模的试验性研究面上大部分的样品管规格，适合于较小规模的试验性研究和方法开发工作。另一款是落地式全自动化操作平台，适合标准化流程作业和以及大群组样品类型的项目型研究工作。两种仪器都可以处理冷冻的原始粪便样本，或冷冻的悬浮处理粪样本，目前正广泛应用于各个知名的肠道微生物组研究实验室。

 

 

在当前的研究中，收集和处理人类粪便样本用于分析肠道微生物菌群面临诸多挑战，不仅在收集流程以及物流运输的安全性上，还有维持样本呈现在体内状态时的分子谱的完整性上，存在着许多难以解决的问题。由于每个排泄物样本的固化程度、水合作用程度以及组成物质有很大的不同，这就给通过物理手段上处理并通过标准化取定量的样品进行分析造成了很大的困难。又因为固体颗粒物会堵塞枪头，即使研究人员采用粪便悬液样本，也难以实施标准液体自动化处理。尽管在转移和处理样本的准确度和可重复性上存在一定的困难，但另一个更重要的核心问题就是如何保持微生物分子生物方面的完整，因为粪便样本中充满了大量核酸酶和RNA酶，他们的存在使得RNA和元基因组的分析变得更为困难。

 

通过消除反复冻融的操作，保持活体微生物遗传图谱特性。

冷冻取样技术可整合到基因组研究的工作流程中，提高研究效率，最大限度地提高样本存储率。

可对原始样本进行重复取样，无需进行反复冻融即可满足对样品进行冷冻分装的需求。

 

为了使粪便样本中的核酸含量保持稳定，科学家们已经尝试了多种不同的方法，包括加入复合种类的酶抑制剂、在缓冲液中添加lOOmM的EDTA、还原剂以及乙醇混合物，低温冻存样本甚至对样品进行冻干处理。

 

针对以上困难，我们提出了一种全新的样本处理方法，可以在尽量保证样本遗传信息完整性和降低分子谱变化的潜在风险。通过冷冻样本取样，在分析之前，我们可以让样本在处理、转移和存储的整个过程中保持冷冻状态，从而保持粪便样本的分子谱完整性。此外，通过冷冻取样技术，我们可真正实现半自动化／全自动化技术来处理更多的粪便样本，最大限度地避免操作人员暴露于潜在的有害物质中，进一步规范作业流程。例如像瑞士洛桑联邦理工大学(EPFL)的雀巢健康科学院和卢森堡联合生物样本库(IBBL)等实验室已经成功地将半自动桌面型冷冻取样技术应用于他们的肠道微生物组的研究工作中。法国国家农业研究院(INRA)则在其大型研究项目工作中采用了全自动化的技术方案（CXT750冷冻样品取样仪），实现了样本处理和存储工作流程的标准化和规范化。

 

图1：冷冻样品取样仪与法国农业科学研究院(INRA)粪便微生物菌群研究流程进行整合

 

图2：冷冻样品取样和人工取样的冷冻粪便样本的宏基冈组比较   在宏基因组分析处理之前，按照以下三个条件，对II名志愿者的粪便样本进行处理。条件1：人工分装的冷冻粪便样本，和来自经过固定、均相并在室温下放置了一周后的进行冷冻分装样本进行比较：条件2：将手动取样的冷冻粪便样本与稳定的、均匀的、在环境温度下贮存l周的经冷冻取样的粪便样本进行对比：条件3：人工分装的冷冻粪便样本，和来自经过固定、均相并在-80℃存放一周后的进行冷冻分装样本进行比较。对每个条件下的样本进行测序，并使用Spea rman软件进行宏基因组的数据比较分析，以比较并确定每种取样技术的差异。所有条件都显示出高分值的相关性(>0 8)。其中，条件3相关性最佳，条件1相关性最差。

 

 

任何肠道微生物研究工作的起点都是从患者和志愿者那里收集粪便样本，收集方法会根据操作流程和容器的不同而有所差异。考虑到研究项目的性质、规模以及存储要求，样本会被保存为原始状态或者进行悬浮处理。考虑到收集容器的类型和采集后的样本制备，冷冻样品取样技术能够处理大部分类型的冷冻粪便样本规格。CXT350冷冻样品取样仪擅长处理大多数类型的样品收集容器，从2.0毫升小型冻存管到50ml的大型离心管，都可以快速进行设置，以适应当目前种规格的管型。CXT750冷冻样品取样仪可以实现完全自动化的冷冻样本处理，适用于分析通量要求更高的作业环境。如果在样本收集时或者收集后立即对样本进行悬浮化或标准化处理，CXT 750将在标准化工作流程和集中存储的实施过程中，成为强有力的实验工具。

 

一般而言，冷冻粪便样本可以根据需要随时进行提取样，而母样则始终保持在冷冻状态（以供日后研究）。另外一种办法是，根据预先计划的研究项目需要或样本库建立/规格重排的需要，母样本可直接被冷冻取样等分为若干数量的子样本，方便日后使用。

 

该方法仅在无需对母样本进行保留时使用。

 

无论是否采用冷冻取样方法，在没有多次的反复冻融的情况下，冷冻取出的样本都可直接用于大多数核酸提取工作。法国农业科学研究院的研究人员近期通过冷冻取样技术，验证了这一技术在粪便/肠道微生物研究领域的作用（参见图1）。法国农业科学研究院将冷冻取样技术与之前的取样方法进行对比，进一步研究这一新技术是否适用于他们拟实施的研究项目。

 

 

经大量研究证实：我们的肠道菌群与健康、疾病之间存在着复杂的相互关联，所以，肠道微生物组研究的重要性正变得越来越明显。由于越来越多的证据可以证明：不同的肠道微生物菌群的形态与诊断、预后之间存在着极强的相关性，甚至是因果关系，科学家们因此也越加关注这一领域的研究。因此，涉及人类粪便样本采集和分析的研究越来越多，规模也越来越大。目前，在人体肠道微生物菌群的研究中，想要有效和安全地处理大量半固态或悬浮态粪便样本，冷冻样品取样技术是唯一可行的解决方案。

 

1该资料和数据由法国农业科学研究院(INRA )MetaGenoPolis项日的Joel Dore博上提供。

 

可容纳并处理市面上大部分的样品管规格，亦可根据需要进行定制，最大限度地提高了在实际应用中的灵活性。

 

通过消除反复冻融的操作，保持活体微生物遗传图谱特性。

 

冷冻取样技术可整合到基因组研究的工作流程中，提高研究效率，最大限度地提高样本存储率。