中空纤维过滤技术在百白破疫苗中的应用

 

王奕军    通用电气医疗集团

 

 

    百日咳、白喉、破伤风混合疫苗简称百白破疫苗，它是由百日咳疫苗、精制白喉和破伤风类毒素按适量比例配制而成，用于预防百日咳、白喉、破伤风三种疾病。目前使用的有吸附百日咳疫苗、白喉和破伤风类毒素混合疫苗(吸附百白破)和吸附无细胞百日咳疫苗、白喉和破伤风类毒类混合疫苗(吸附无细胞百白破)。目前国内的工艺基本上属于七八十年代工艺，整个过程中所用的透析步骤,常规过滤的步骤非常多,这样大大的影响了整个制品的工艺生产进程。

 

    GE公司的中空纤维是设计为开放式通道的切向流膜过滤产品，在整个生物下游分离中具有低剪切力，高活性收率的优点，特别适合处理高浓度、高粘度、高颗粒度样品的分离。根据中空纤维的独特的优点，我们对百白破工艺流程中作了一些有益的尝试，获得了不错的结果。

 

图１:百日咳工艺流程

 

      在整个工艺过程中，我们在第(３)步工艺，透析脱去铵离子的这一步，以及工艺第(6)步,透析去除解毒剂戊二醛这一步分别作了有益的尝试，取得了不错的实验结果。

 

    中空纤维脱铵离子实验

      图２Quixstand 系统

 

    实验膜类型：10KD的滤柱(UFP-10-C-4MA) 。

    实验条件：泵转速-200rpm，上样体积1000ml，过膜压力 18psi 。

    实验料液：百日咳工艺第(３)步料液,脱去铵离子之前料液(高速离心后料液) 。

    实验过程：百日咳工艺第(３)步盐析沉淀和缓冲液抽提百日咳毒素和丝状血凝素,之后透析脱去铵离子,传统工艺上面是高速离心后再透析去除铵离子(高速离心前的料液非常混浊,)整个透析的时间很长,一般需要２天左右,完全是一个工艺的限速步骤,这边实验尝试用分子量 10k分子量的中空纤维代替透析,取得了不错的实验结果,基本上在滤出体积为原体积３-４倍左右的时候即可检查出铵根离子符合工艺要求,整个实验过程仅需要２小时左右,而且由于中空纤维可以处理高颗粒高粘度颗粒的特性,我们也继续尝试把原来非常混浊的料液浓缩2-3倍之后再次洗滤,也是在滤出体积为原体积２-３倍的时候即可达到铵离子合格的结果,这样可以节约后续的离心体积,也节省了工艺的时间。

 

    中空纤维脱去戊二醛实验

 

    实验系统：Quixstand系统

    实验膜类型：10KD的滤柱(UFP-10-E-4MA)实验条件:泵转速-260rpm ,上样体积 1000ml,过膜压力15psi 。

    实验料液: 加入戊二醛进行解毒的百日咳料液工艺流程第(６)步。

    实验过程: 实验过程采取了先对料液进行浓缩5倍左右,后续立即洗滤,洗滤体积为8 倍体积后即可达到戊二醛合格的结果在透析去除戊二醛这一步,样品溶液属于一个多絮状的状态,传统工艺上透析袋去除戊二醛,一般都需要三天以上的时间,给整个工艺过程带来了不稳定因素,透析时间过长一方面容易染菌,另一方面也对蛋白的收率活性带来一定的影响,这边尝试用 10k中空纤维代替透析, 在滤出体积为原料液体积８倍以上体积时候即可达到去除戊二醛的目的,另外我们也尝试实验过程采取了先对料液进行浓缩5 倍左右,后续立即洗滤,在滤出体积为滤体积为４-５倍体积后即可达到戊二醛合格的结果,,整个工艺时间基本上 2-3 小时,而且操作为全封闭操作,大大的增加了整个生物制品的安全性。

 

图3:白喉或者破伤风毒素工艺流程

 

    在工艺流程(2)中用绢布过滤来收集上清,整个时间耗时 10 小时或者更长,这么长时间的外置于空气中,一方面带来料液容易污染的危险,另外一方面出来的料液澄清度也比较差,会在一定程度上影响最终制品的性质. 我们尝试着在这一步工艺流程中用中空纤维代替原有的步骤,得到了不错的经过,不但料液非常澄清,而且活性几乎没有损失。

 

 

    实验系统:Quixstand 系统

    实验膜类型:0.45um的滤柱(CFP-4-E-4MA)

    实验条件:泵转速-320rpm ,上样体积 1000ml,过膜压力 5.5psi

    实验料液: 加入活性炭后进行脱色的料液,工艺流程第(２)步

    实验过程:采取了先将料液进行浓缩至900ml,之后进行洗滤的方法,在滤出料液体积为原料液体积2.5 倍体积停止实验,经过活性检测基本能将发酵液中目的毒素完全滤洗出来,达到了很好的实验结果,整个实验耗时两个小时左右,大大节约了工艺的时间.

 

 

    实验系统:Quixstand 系统 。

    实验膜类型:0.45um的滤柱(CFP-4-E-4MA) 。

    实验条件:泵转速-320rpm ,上样体积 1000ml,过膜压力 3psi。

    实验料液: 加入活性炭后进行脱色的料液工艺流程第(２)步。

    实验过程:采取了先将料液进行浓缩至600ml,之后进行洗滤的方法,在滤出体积为原体积2倍体积停止实验,基本能将发酵液中目的毒素完全滤洗出来,达到了很好的结果,整个实验耗时两个小时左右,大大节约了工艺的时间。

    白喉破伤风毒素工艺流程除了这一步之外,实验也同样尝试用 30k中空纤维在白喉以及破伤风毒素上去除铵离子的过程,同样得到了非常好的结果.在很短的时间内即可把铵根离子去除。

    GE 公司的中空纤维由于独特的开放式结构,使它能处理高浓度,高粘度,高颗粒的样品,能代替原有的粗放式过滤,以及透析的过程,达到去除菌体,戊二醛,铵根离子的目的,在百日咳破伤风白喉毒素的工艺过程中得到了很好的应用。

图四:全自动膜过滤系统

 

    GE 公司提供的中空纤维系列滤柱 (HF) 及系统，具有以下优势：

●购置/使用成本合理；

● 各种微滤孔径、超滤分子量可选；

● 大多数滤柱可高压或者在线蒸汽灭菌；

● 纤维管内径可选，适合处理高浓度、黏度、颗粒度的样品；

● 安装操作简单 ；

● 全封闭操作；

● 符合 cGMP/FDA 严格的安全、可控认证要求；

●GE 公司同时拥有实验室全自动膜工艺开发以及满足生产的全自动膜系统,确保满足客户从实验室的工艺优化以及线性放大工作。

图５  Grandstand 550生产系统