不连续Nycodenz梯度溶液中原代细胞溶酶体的分离

              不连续Nycodenz梯度溶液中原代细胞溶酶体的分离

试剂和器材： 
1.匀浆介质：0.25mol/L蔗糖溶液、1mmol/L乙二胺四乙酸、10mmol/L Hepes-NaOH，pH7.4；
2.Nycoprep^TM Universal；
3.磷酸缓冲液pH7.4（50mmol/L）
4.Nycoprep^TM Universal稀释剂：6mmol/L乙二胺四乙酸、60mmol/L Hepes-NaOH，pH7.4；
5.Nycodenz工作溶液（500g/L）：将5体积NycoprepTM Universal和1体积NycoprepTM Universal稀释剂混合；
6.按要求向溶液中加入蛋白酶抑制剂；
7.线粒体组分；
8.超速离心机，带有配置约38ml容量离心管的吊桶式转子（也可用较小的17ml或13ml离心管）；
9.10ml规格注射器（内径大约0.8mm），带金属套管针；

实验方法：
所有操作在0—4℃下进行。
1.用匀浆介质对Nycodenz工作溶液进行稀释来产生Nycodenz浓度分别为300g/L、260g/L、240g/L和190g/L的梯度溶液，将这些溶液保持在0—4℃；
2.在匀浆介质（4—10ml）中重悬冲洗过的线粒体沉淀，再与2倍体积Nycodenz工作溶液混合；
3.对于36—38ml的小管，在每个小管中用带金属套管针的注射器加8ml 190g/L Nycodenz于底层，从240g/L、260g/L和300g/L的Nycodenz各取7ml，再加入8—9ml线粒体沉淀混悬液；
4.在95000g下离心2h，然后从190g/L与240g/L Nycodenz界面上收集溶酶体或者在进行标记分析之前，分级收集全部梯度组分；