应用非标记探针法进行基因分型

      RET原癌基因单个碱基的突变可以引发多发性内分泌腺瘤2型。RET突变传统的基因分型方法是外显子测序。一种闭管操作的基因分型方法已经成熟，此方法用的是一种饱和DNA染料，非标记探针及高分辨率熔解扩增子分析。此方法需要两个连续的聚合酶链式反应阶段，主要的和第二次实验。主要的实验共用7个反应和8个非标记探针分析RET基因外显子10、11、13、14和16 。主要实验基因分型了野生型外显子，外显子13普通的多态性，外显子16的一个突变及其它检测到的序列变化。主要非标记探针数据限制检测到的RET基因序列突变的基因分型，这些突变位点的基因分型在第二次实验的2-5个反应中进行。设计6条探针，所用方法是：用遮蔽技术和遮蔽选择的序列变化使探针下其它位置的突变的分析变得明确。这两步RET基因分型之后，少于实验0.2%的外显子需要测序确定基因型。对5个野生型和29个可用的RET序列突变样品（与测序结果100%一致）做盲研究。用非标记探针和遮蔽技术进行高分辨率熔解分析是快速、精确的基因分型方法，>50的RET序列突变可以进行基因分型。

      多发性内分泌腺瘤2型（MEN2）综合症，MEN2A，MEN2B及家族性甲状腺髓样癌由生殖细胞系RET基因外显子10、11、13和16的突变引发。MEN2综合症是常染色体显性秩序失调引起的高生命危险的甲状腺癌。RET突变的遗传学检测可以确认处于甲状腺癌危险中但是没有爆发癌症的病人，此时切除甲状腺可以增加存活的机率。
      之前有许多实验方法检测或基因分型RET突变，比如说单链构象多态性，变性梯度凝胶电泳，温度梯度毛细管电泳，限制性内切酶消化PCR产物，焦磷酸测序，荧光标记杂交探针及微卫星。但是，这些方法中的大多数需要PCR反应之后的操作来检测突变。其中一些方法报道突变检测的敏感性为95%或少于95%，或者仅实验了RET突变样品的一小部分。这些方法分析RET序列变化的限制范围，可能只以普通突变为目标而错过了稀有突变。此外，不致病多态性的存在可以导致异常的结果。因为这些限制，RET外显子测序保持黄金标准。
      测序是一种耗时且昂贵的开管实验，需要生成PCR产物之后的额外操作。相反，高分辨率熔解曲线的突变扫描分析是一种快速且便宜的闭管操作实验，不需要进行PCR产物之后的额外操作。通过用一种饱和DNA染料：LC Green，高分辨率熔解曲线分析可以检测PCR扩增子之内的序列变化。对检测PCR扩增子内杂合点突变的高分辨率熔解技术的系统研究发现，检测400bp之内的扩增子的敏感性和特异性是100%。最近，我们证实用高分辨率熔解分析进行RET外显子突变扫描。虽然这种方法在盲实验中检测100%的突变，但是有些罕见的突变的熔解曲线相似，完全进行基因分型是困难的，在这种情况下，在最初的突变扫描之后需要测序。另一种方法，添加杂交探针可以分出RET突变的绝大多数的基因型，而不需要测序。
      荧光标记杂交探针分析是一种快速、闭管操作的实验，可以通过探针/等位基因的熔解温度基因分型序列变化，但是需要昂贵的寡核苷酸修饰。非标记探针也可以通过Tm的不同进行基因分型，也是一种闭管操作的实验，需要LC Green染料。因为用DNA饱和染料检测，非标记探针和扩增数据可以从一个熔解曲线分析。Zhou等最近证实非标记探针基因分型分析可以补充突变扫描。但是，在同一个外显子之内的RET所有突变不能只用一条探针进行基因分型，因为探针下特定突变的熔解温度相似或相同。
      为了完成闭管基因分型实验，发明了两步RET基因分型方法，此方法比测序技术成本低，耗时少。用于扩增熔解的第一个PCR阶段（主要实验），扫描RET外显子的序列变化，反之，非标记探针分析位于突变范围内，且分辨可能的基因型。第二个PCR阶段（第二次实验）需要限定数目的特定突变的探针对>50的RET序列突变进行明确的基因分型。用遮蔽技术设计的探针简化了突变分离。当探针下有多重的可能的序列突变使分析变得复杂时，遮蔽技术简化了探针熔解的判断。在多态位点选择含有错配的（缺失、不匹配碱基或一般碱基）可以遮蔽的序列变化。这样的话就在遮蔽多态位点人为的创造了一个与可能的等位基因的错配。野生型与遮蔽突变的等位基因都有一个与探针错配的碱基和相似的Tm。然而，突变等位基因在探针下其它的位置有一个额外的错配，可以通过比仅在遮蔽位置变化的等位基因稍低的Tm值鉴定。

材料和方法

样品
      此报道中用到的野生型RET基因的DNA基因组样品或有RET序列变化的样品在以前描述过。RET基因序列变化改变RET蛋白的功能引发MEN2综合症的是突变，然而RET序列改变不会引发MEN2综合症是多态。不能确定意义的稀有的或不会引起MEN2综合症的RET基因序列变化成为“序列变化”。在这份报告中，通过密码子数列出RET序列变化，野生型编码DNA序列后面是编码序列改变，伴随着加粗突变核苷酸（例：618（TGC→TAC）），反之多态及序列变化用下划线标出。所有测试的RET序列变化的样品均有单个核苷酸改变，并且是杂合的除非有另外的阐明。RET突变基因型和多态性及序列变化基因型列于表1。

*序列变化是杂合的除非在文本上另作说明。密码子DNA序列列出核苷酸改变，加粗突变且多态性或序列变化使加下划线的。•，可用的RET序列变化样品。
†未知意义的稀有序列变化或不引发MEN2综合症；查看参考文献。在RET致病密码子范围内密码子609或611的3个突变体与MEN2综合症没有联系。密码子922和852的突变体以前在MTC病人上发现过，也许不会引发MEN2综合症。
‡良性多态性，0.26等位基因频率。
§806与804突变在同一等位基因时致病。

引物和探针
      用完整DNA技术合成寡核苷酸。用Primer3设计引物。选择引物和探针检测所有已知RET突变，不包括分析中的普通多态（表2）。非标记探针包含有3’磷酸化或3’氨基修饰（整合DNA技术），避免PCR反应中的延伸。设计的探针用于分析每个外显子的突变热点。
      RET基因分型实验中用了4种非标记探针（表2）：野生型（WT）探针，特定突变（MS）探针，只遮蔽单一多态核苷酸的遮蔽探针，遮蔽3个多态核苷酸的位置探针（一个密码子）。比如说，外显子13遮蔽探针（遮蔽1bp 769）在多态核苷酸位置有单个碱基的缺失。（WT13探针的“T”位置，表2）。外显子10和11位置探针与野生探针序列相比有3个核苷酸缺失，遮蔽一个致病密码子分辨密码子突变的位置。外显子10和11在致病密码子位置有同样的序列改变。比如说：外显子10，MS618/620TAC探针在密码子618-620有TAC序列， 如表2描述。

*最终引物的浓度和上下引的比例在引物序列上显示。列出引物序列从5’到3’，上游引物在下游引物上部。
†每个探针集下是密码子的变化。下划线密码子包括了多态或序列变化，反之其它密码子包括突变。
‡遮蔽，遮蔽1-3个核苷酸的缺失。主要实验中的野生型探针序列用于每个外显子，除了外显子16。如果两个野生型探针用于一个外显子，标记做A和B探针。
§探针序列从5’到3’显示，RET外显子10、13、14和16是上游探针，反之，外显子11是下游探针。已知突变的位点加粗，可能的多态性或序列变化位点用下划线表示。
¶位置（L）探针与野生型探针序列致病密码子相比有3个核苷酸遮蔽缺失（---）。
‖用于外显子10,11突变的基因分型的MS探针的例子。在探针内致病密码子位置的相同的特定突变序列。这些探针有特定突变序列的名称，改变的序列加粗。有7个可能的从TGC 野生型半胱氨酸到其他氨基酸的突变序列改变。因此，21个MS探针中的7个特定突变探针（AGC，CGC，GGC，TAC，TCC，TTC，TGG）是用于外显子10和11突变。用于每个突变基因分型的MS探针用图解法表示，表3和补充表格1-5。
**外显子13的主要和第二次试验用遮蔽探针。遮蔽 1bp 769 主要探针及外显子特定突变探针在密码子769多态位置有单核苷酸缺失（缺失野生型探针序列有下划线的“T”）。
††外显子16用918（ATG-ACG）密码子特定突变探针做主要实验。

PCR
      用之前描述的不对称快速PCR扩增样品DNA，除了用表2中给出的引物浓度反应55个循环。外显子14反应包括2个探针，0.5μmol/L的WT14A探针和0.25μmol/L的WT14B探针。在主要实验和第二次实验一个野生型对照与每个探针一起参加反应。外显子13， WT13主要的实验反应用2个额外的对照：杂合和纯合密码子769样品。外显子10主要实验反应用620（TGC→AGC）突变样品作为正对照。

高分辨率熔解 
      在高分辨率熔解仪器HR-1（爱荷华科技，盐湖城，犹他州）上进行分析，将LightCycle毛细管加入HR-1中，0.3℃/s加热。主要的实验中，RET外显子的扩增及非标记探针熔解数据从60℃到95℃采集。主要实验分析了每个外显子的扩增子及探针数据，除了外显子14。因为所有报道的外显子14突变都包含在非标记探针下，只分析了探针数据。第二次实验，只分析了在60℃-89℃采集的非标记探针熔解的数据。

      高分辨率熔解数据用之前描述由LabView编写的定制软件分析。简言之，扩增子的熔解曲线数据是规范化的，温度转移之后转换成派生图或荧光差异图。依据用于扩增分析的数据图，由于从野生型对照的视觉偏移的不同曲线形状较宽的派生熔解峰，独特形状的熔解峰（肩峰或两个峰），熔解温度的偏移，和/或荧光不同来检测序列变化。扩增熔解曲线，派生图，荧光不同的图都可以用来检测RET序列变化。非标记探针熔解数据直接转换成派生图。外显子14探针数据标准化，在分析之前指数背景已消除。
在派生熔解峰的1/2出估计非标记探针数据的Tms。杂合样品的△Tms定义为野生型等位基因Tm减去变化（突变，多态性，或序列变化等位基因）等位基因Tm的值。注意：当变化等位基因的Tm值高于野生型的等位基因Tm（例如：和互补的特定突变探针），△Tms的值是否定的。杂合样品的探针数据导致肩峰或平稳形状的峰，峰面积分为1/4，1/2和1/4野生型范围，变化等位基因Tms在这些区域的边界。因为纯合子序列变化（没有野生型等位基因）或变化等位基因Tm值与野生型等位基因Tm值相同时（没有可识别的野生型等位基因）当只有单个峰是显而易见的。之后，野生型对照样品Tm在计算△Tms时用于计算野生型等位基因Tm。野生型样品也会导致单一的峰，所以，从野生型对照Tm减去样品的单个等位基因Tm值。
每个RET序列变化的主要探针△Tm值决定用于第二次基因分型实验的特定突变探针。如果RET突变无法利用（表1），用之前描述的临近的参数估计预计△Tms值。以经验为主的决定和预测RET序列变化的△Tm值与主要探针确定△Tm的范围，期望特定探针选项分组突变。补充表1-5（参阅http://jmd.amjpathol.org）显示△Tm的范围及主要探针分析的突变分组及每个可用的RET序列变化和主要探针及选择的第二个探针的△Tm值。Tm标线放置在派生的平面图，通过从野生型对照等位基因的Tm减去主要实验的△Tm范围计算Tm，如外显子10和11主要探针所示。这些Tm知道方针便于快速、视觉分组突变样品，选择第二次试验的特定突变的探针。但是，计算每个样品的△Tm值可以更好的对照由特定样品的不同引起的系统Tm值的偏移（改变盐的浓度，不同的样品提纯方法或温度不精确）。

盲研究
      29个RET突变样品（表1中列出的可用的突变，多态性和序列变化）和5个野生型样品用于生成盲研究。外显子13，14各分析10个样品，外显子11分析20个样品，外显子10分析28个样品（补充表格6， http://www.jmd.amjpathol.org）。每个外显子，野生型样品和变化的样品数目是未知的。盲研究扩增分析，用派生熔解曲线数据的独特的派生峰形状和从野生型对照的Tm移动可以明显的区分序列变化，虽然RET序列变化可以在三种平面图中检测：熔解曲线，派生熔解曲线，荧光信号不同。用WT10A，WT13探针的主要实验的扩增子派生熔解数据分别用来扫描外显子10和13的突变。
      从主要实验的每个样品的探针数据计算△Tm值（如果需要，从第二次实验中计算）。△Tm数据表用来决定基因型或从第二次实验中选择特定突变的探针（补充表1-5；http://jmd.amjpathol.org）。表3（补充表1-5的简化版本，http://jmd.amjpathol.org）显示了RET基因分型实验的实验原理图，也可以用于选择第二个探针。Tm标线选择外显子10和11特异突变探针的能力与用计算每个样品的Tm值来选择探针相比较。主要实验之后，样品标记为野生型，外显子13多态性， 外显子16密码子918突变，或其他RET序列变化。检测序列变化的主要探针的△Tm值决定用于第二次基因分型实验的特定突变探针，在RET序列突变的地方进行基因分析。

结果

实验设计
      RET外显子10、11、13、14和16的基因分型通过两个步骤完成，闭管实验设计包括主要和次要的实验（表3）。因为用了DNA双链饱和染料，每个反应生成非标记探针和扩增子熔解数据。主要实验包括7个PCR反应和8条探针，用于扫描序列变化和分辨一些基因型（野生外显子，外显子13密码子769多态性和外显子16密码子918突变）。在主要实验中只检测了序列变化但没有基因分型的外显子在第二次实验中用选择的探针进行测试。只用扩增数据检测稀有序列变化的样品（探针下的野生型序列）或在第二次试验中用特定突变探针没有基因分型的稀有序列变化需要通过测序来确定基因型（实验的外显子的~0.2%）。

*RET5个外显子的主要实验中包括了7个PCR反应和8条探针（外显子14是多重的）。列出的主要探针与每个RET外显子相对：WT，野生型；MS，特定突变。主要实验用外显子13密码子769（CTT→CTG）多态和外显子16密码子918（ATG→ACG）的突变的探针及扩增子的熔解数据来区分野生型。从主要实验数据（检测外显子的7%）中的△Tm值选择第二个探针，检测其它的序列变化。有两个例外，样品需要测序（很少）：1）外显子16检测的其它序列变化而不是密码子918突变，或2）主要探针检测的序列变化的△Tm值在选择的第二个探针给定范围之外。这样的话主要探针会检测到两个以上的序列变化或检测到异常序列的变化。
†列出的主要实验的Tm值用于决定样品的基因型或检测在扩增子之内但是不在探针下的稀有序列变化。野生型样品在野生型对照的0.25℃范围之内。
‡ 野生型序列在探针下。调用野生基因型的分析扩增数据或检测在扩增子之内但是不在探针下的稀有序列变化（扩增熔解曲线偏移虽然探针数据显示是野生型）。只用扩增熔解数据检测出来的稀有突变需要测序判断基因型（实验的外显子<0.2）。
§由于突变或普通密码子769多态的序列变化。遮蔽1bp 769探针区别WT13探针检测到的其它序列变化的多态性。
¶用主要实验探针检测外显子的序列变化部分。
‖只有第二次实验的探针用于主要实验检测出来的序列变化的基因分型。根据主要探针与样品的△Tm值选择  探针，形象的用Tm标线（图2a，补充的图1a和2a；http://jmd.amjpathol.org）或计算Tm值（补充表1-5；http://jmd.amjpathol.org）。如果选择的探针不能基因分型序列变化（外显子的0.2%），需要对样品进行测序，例：外显子11（GAC→GAT）多态性。
**位置探针（L）：L10A611遮蔽，L10B620遮蔽，L11634遮蔽分别与主要实验探针WT10A，WT10B和WT11一起使用检测序列变化。

外显子10和11：多重突变热点
     MEN2A和FMTC的主要突变位于外显子10（密码子609、611、618和620）和11（密码子630和634），且野生型半胱氨酸的密码子DNA序列“TGC”发生单核苷酸改变。外显子10和11报道的序列变化>40（表1）。
     RET10外显子的主要实验包括两个单独的实验和两条探针。WT10A探针覆盖了密码子611和609，WT10B探针覆盖了密码子618和620（图1a）。所有密码子618和620突变的样品在WT10A探针下有野生型序列且有和野生型对照样品的Tm值相同（图1b）。五个密码子609和611样品中的每一个都含有一个突变等位基因，比野生型等位基因的熔解温度要低。相反的，WT10B探针，密码子609和611突变样品的Tm值和野生样品的相同，但是每10个密码子609和611突变样品有一个突变等位基因，熔解温度比野生型等位基因低（图1e）。外显子10所有的RET序列变化通过用高分辨率熔解曲线分析的标准化熔解曲线，派生图或荧光信号的不同数据（图1、c、d、f和g；数据没有显示）来检测。这些数据证实了不在非标记探针下的突变可以用扩增熔解数据检测出来（例：图1中比较蓝色突变的痕迹，b对c）。

图1：检测RET外显子10序列变化的主要实验。a：RET10外显子10的图示，红色方块显示密码子609和611，蓝色的方块显示密码子610和620。外显子10的主要实验用WT序列的两个非标记探针。如图所示，WT10A探针检测密码子609和611突变，反之WT10B检测密码子618和620突变。每个图中，显示一式两份三个野生型对照（WT，黑色痕迹），及一式两份（红色痕迹）两个密码子609和三个密码子611突变样品、五个密码子618和620突变（蓝色痕迹）。3个左面的图是WT10A探针反应的非标记探针和扩增子的高分辨率熔解数据，右面的3个图是WT10B的数据。对于每个探针，最厚重的痕迹线与探针检测的突变一起使用，稀疏的痕迹线只于扩增子检测的突变一起使用。b：WT10A探针数据的派生熔解图。等位基因分为两个Tm范围，且每个范围有预测的密码子突变等位基因（609/611突变或618/620突变），与WT等位基因一起列出。c：WT10A探针与WT主要实验和标记的外显子10突变样品的扩增派生熔解曲线。d：同样扩增数据的不同平面图。e：WT10B探针的数据的派生熔解平面图。等位基因分为两个Tm范围，且每个范围有预测的密码子突变等位基因， 与野生型等位基因一起列出。f：WT10B探针与野生型主要实验和标记的外显子10突变样品的扩增派生熔解曲线。g：同样扩增数据的不同平面图。

      在主要实验中用野生型探针识别每个探针下的野生序列，样品Tm值与野生型对照等位基因Tm值相差±0.25℃（表3；补充表1；http://jmd.amjpathol.org）。RET序列变化的样品有一个等位基因，其Tm值小于野生型等位基因，△Tm值>0.25℃。限制在第二次实验中基因分型需要的特定突变探针的数目，△Tm值范围用于安装相似的△Tm值分组RET序列变化。△Tm值值的范围用于快速生成Tm标线，视觉上选择第二次试验探针。例如：图2a的WT10B探针数据显示13个样品通过Tm标线，视觉上分为一个野生型组和两个突变组。第一个突变组，包含密码子618或620的TAC、TCC、TTC和TGG，△Tm值在3.3℃到5℃的△Tm范围内（图2a；表3；补充表1；http://jmd.amjpathol.org）。这一组的样品在第二次实验中MS10B的探针集1需要4个探针（图2，b-e）。第二个突变组，包括密码子618和620的 AGC、CGC和GGC突变，△Tm值在0.25℃到3.3℃的△Tm范围内。这个突变组在第二次实验中MS10B的探针集2需要3个探针（图2，f-h）。相同的方法用于包含密码子609和611突变的WT110A探针数据（表3；补充图1；补充表2；http://jmd.amjpathol.org）。外显子10的主要实验用的△Tm值来自于两个外显子10的野生型探针限制来自28至≤8基因型未知突变的可能基因型。
      为了减少第二次实验中基因分型突变所需的探针的数目，外显子10的每个特定突变探针在致病密码子范围有相同的序列改变（表2）。一个致病密码子的补充突变等位基因导致与探针只有一个错配，且Tm值比有两个错配（表2，b-h）的野生型等位基因高2℃-5℃ 。如果突变在不同的位置，突变等位基因与探针有三个错配，且熔解Tm值低于野生型（例，图2 TGG突变，b-d，粉色痕迹）。如果突变与探针序列改变在同一位置，但是不与探针互补，此时突变等位基因的Tm值接近于野生型等位基因的Tm值，因为这个等位基因与探针有两个错配。分析时，如果与野生等位基因熔解曲线不相同，这些突变等位基因因为熔解曲线相似而被遮蔽（如：图2g遮蔽的AGC和GGC，红色和灰色的痕迹）。偶尔，一个突变等位基因和非互补特定突变探针会显示比预期高的遮蔽熔解。例如：密码子618（TGC→TCC）和620（TGC→TCC）突变比野生等位基因和MS618/620TAC和TTC探针（图2， b和d，橙色痕迹）较稳定（△Tm-1.7℃至-2.0℃）。即使如此，两个杂合TTC突变通过与互补MS618/620TCC探针（△Tm-4.7℃）的较高的Tm值而容易区分（图2c，橙色痕迹）。