用日立特制的高速组织培养管分离细胞膜

 

一般的50 ml 培养管离心时允许使用的最高转速都在12,000rpm 以下，Hitachi 在CR—G系列高速冷冻离心机中配置了新型的专用于组织培养管的转头R18A（18,000rpm，42,000xg，8×50ml TC管）并为此专门定制了高强度的50ml 锥底TC管。用这种转头分离细胞器，离心时间短，分离效果好。

 

设备：

Hitachi CR21G 或22G 高速离心机，R18A转头（可高温消毒，121℃，20分），himac 50 ml TC管

 

分离步骤：

1．成年鼠肝匀浆4,000rpm（约2,000xg） 离心15分，4℃（R18A转头，8×50ml）

2．沉淀用1mM NaHCO₃ 稀释再在4,000rpm离心15分，4℃

3．沉淀按湿重1g/ml NaHCO₃ 稀释后配成68％蔗糖液，置于离心管下部，上部用42％蔗糖液

4．R18A转头，18,000rpm（42,200xg），4℃离心90分钟，加速“5”减速“5”

5．离心后在42％与68％蔗糖液之间形成粗制细胞膜

6．粗制细胞膜吸出后用1mM NaHCO₃ 稀释后再离心4,000rpm（近2,000xg）4℃离心30分，并重复此实验二次

7．去除上清液沉淀再用1mM NaHCO₃ 稀释，在50ml TC管中，从底部依次向上铺设：68％蔗糖液（用稀释的样品配成）、48％蔗糖液、42％蔗糖液。

8．铺好后再次离心，R18A转头，18,000rpm，4℃，90分钟，加速“5”减速“5”

9．离心结束后可以看出细胞膜分布在42％与48％蔗糖液之间

 

讨论：阶梯形蔗糖梯度在50ml TC管中用高速离心机分离亚细胞构造（膜、线粒体、溶酶体、高尔基复合体、微体等）由于日立开发了高强度的组培养管而变得更为可行。以上只是一个例子，我们可以选择不同的蔗糖阶梯度来分离细胞器，可以得到相当高的纯度。除了蔗糖梯度以外，用Percoll及Nycodenz 的自形成、予形成或阶梯梯度分离亚细胞构造，近年来已被广泛应用。