通过超高效液相色谱（ACQUITY UPLC ）提高色谱分离能力并减少溶剂用量

在当今的经济形势下，需要以较少的资源实现更多成果，而“快速”是分析化学领域内经常听到的一个主题。液相色谱法已成为药物分析、环境监测、食品检验和水质监测等领域内众多定量及定性分析的主要工具。通过 ACQUITY UPLC ® 系统取得的生产能力、选择性及特异性除了比传统的 HPLC 消耗更少的溶剂外，还可以改善色谱分析结果，使实验工作更加高效。

分析型 HPLC 经常采用 4.6 毫米 x 150 毫米 或 250 毫米 的色谱柱，填充物质的粒度为 3.0~5.0 微米，工作流速为 1.0~1.4 毫升 / 分钟。这样，每个样品的 HPLC 分析时间便是 15~60 分钟。典型的批量需要 10~20 小时完成，分析结果在第二天之前无法用于批签发、下一个临床剂量、工厂的清洁等方面的决策。流速为 1.4 毫升 / 分钟时，这些 HPLC 系统每 20 小时日消耗约 1.5 升 溶剂，其中通常包括 50% 的有机溶剂。这些溶剂必须外购并弃置，这一切都会增加总体分析的成本。在平均 250 日的工作年中，最多会增加近 200 升 的有机溶剂；购买每升乙腈的约需 100 美元，相当于 20,000 美元的可消耗成本。鉴于近期乙腈成本的增加以及全球某些地区的缺货现状，非常需要更加高效地利用该有毒溶剂。图 1 所示为 HPLC 在制药工业的一个应用实例 – 奎硫平杂质分析的代表性样品图谱；从图中可见，梯度分析时间为 51 分钟，色谱柱重新平衡需要 16 分钟。

亚 2 微米多孔柱颗粒的出现以及设计用于利用这些颗粒的优势的仪器均提高了色谱分析的能力。亚 2 微米颗粒色谱效能的增加可显著减少分析时间。因为色谱柱的色谱分辨能力与色谱柱长度成正比而与色谱柱粒径成反比，亚 2 微米材料效能的增加，可减少色谱柱长度而达到相同的效能。可以通过比较 l/dp 比（色谱柱长 / 粒度）来评价；对于一个粒度为 5.0 微米的 150 毫米 长的色谱柱，其 l/dp 比为 150/5 ，比值为 30 。由一个 5.0 微米粒子移动至一个 1.7 微米的色谱粒子时，可以取色谱柱长度为 50 毫米 而不会改变试验的分辨率。由于色谱柱长度随试验的三个因素之一而减小，时间也应该随三个因素之一而减少，从而提高流量。减小粒度时，最佳流动相线性速度与粒度成反比增加。因此，由一个 5.0 微米粒子移动至一个 1.7 微米的色谱粒子时，流动相速度增加 3 倍；与色谱柱长度减少 3 倍相结合，最多可减少 9 倍的分析时间。

图 1 硅硫平的反相 HPLC 分离

图 2 地达诺新及其杂质的 HPLC 与 UPLC 分离（标为 A-F ）。 2A . 5.0 微米粒度的 HPLC 分离。 2B. 1.7 微米粒度的 UPLC 分离。

实际上，科学家们在使用 UPLC ® 时都会因为增加了分离度和较高的色谱波峰间隔而折衷选择流量，因此方法的稳健性更强。由亚 2 微米颗粒物质获得的色谱效能增加与 UPLC 要求的较短的色谱柱长度相结合，会产生较尖锐、同时更加集中的波峰，从而简化了试验过程，例如在生物分析法中。质谱学会已经利用增加的灵敏度和更短的分析时间来提高 UV 和 LC/MS 试验的灵敏度。

为了实现这些亚 2 微米颗粒的色谱效能，必须仔细控制柱前和柱后的谱带增宽，这对于恒溶剂模式（ isocratic mode ）下的运行尤为重要。 ACQUITY 超效能 LC ® 系统专门设计用于开发可由亚 2 微米颗粒 LC 获得的色谱效能，柱前容量约为 80 微升，且色散性极低。没有这种严格的控制，波峰形状就会受到破坏，从而导致较宽的拖尾峰。

与 UPLC 系统相比，后者进样相同的次数会消耗 71 升 流动相。当流动相为 50% 左右的乙腈时，在整个分析过程中就可以节省 174 升 乙腈，成本按 100 美元 / 升计算， 每年节约财务支出 17,000 美元 。

图 3. 奎硫平及其杂技的 UPLC 逆相分离。 3A . 2.1 毫米 色谱柱 I.D. 3B. 1.0 毫米 色谱柱 I.D.

ACQUITY UPLC 系统的独特设计最大限度地减小了系统的延迟体积和系统的分散度，支持使用填充有亚 2 微米物质的 1.0 毫米色谱柱 。图 3B 中所示的数据表明在 ACQUITY UPLC BEH C 18 1.0 毫米 x 100 毫米， 1.7 微米色谱柱上进行的相同的奎硫平杂质分析。样品是在相同的梯度条件下洗提的，其流速大小为 0.181 毫升 / 分钟；这表示溶剂用量比 2.1 毫米 HPLC 分离法减少 77% 。因此，若每年同样要进行 4477 次进样， 1.0 毫米分离只会消耗 16.30 升 溶剂，因此仅消耗 8.15 升 乙腈，溶剂用量 减少 97% 。与 HPLC 分析法相比， 1.0 毫米 UPLC 分析只需 800 美元购买乙腈的成本，相当于进行相同次数的分析 比 HPLC 法节省 20,000 美元 。图 4 所示的数据说明与辅助显像法（ aid visualization ）相比 UPLC 在 1.0 毫米和 2.1 毫米规模下溶剂和成本的节省情况。通过该数据得知， UPLC 不仅更加高产，而且更加经济，因为该方法每年可以少消耗数百升溶剂。

结论

可商购的亚 2 微米颗粒 LC 色谱柱的出现及可利用这些色谱柱的色谱潜力的仪器使色谱工作人员和 LC/MS 科学工作者能够提高其分析工作的灵敏度、质量和速度。 ACQUITY UPLC 系统的独特设计使科学工作者能够以一种比以往更高效的方式取得这些成果。系统不仅更加高效，还比 HPLC 或“快速 LC ”（采用 4.6 毫米 色谱柱，流速更高）或单片固相显著减少溶液用量。本白皮书所示的实例说明，通过迁移至 2.1 毫米 规模的 UPLC 法，可节省溶剂 82% ；通过迁移至 1.0 毫米 规模的 UPLC 法，可 节省溶剂 97% ，累计每年可节省数万美元。

这样的成本节约具有重要的商业意义，使用更少的溶剂和产生更少的废物有益于环境保护。

分析时间

流动相

乙腈

成本

节约额

溶剂用量与 HPLC 和 UPLC 成本对比

图 4. UPLC 在 1.0 毫米 和 2.1 毫米 色谱柱下相对 HPLC 的溶剂和成本节约情况。