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蛋白质印迹

蛋白质印迹


Western Blotting
它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品的某种蛋白的方法。该方法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。
服务类别:免疫与抗体总访问:3681
最后更新:2013-8-1半年访问:51
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服务商: 广州市佰而林生物科技有限公司 查看该公司所有服务 >>
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佰而林服务流程:

 

1、蛋白质抽提
(1)
组织样品,取适合量的新鲜组织样品或正确保存的组织样品(非常重要),加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂或其它蛋白提取试剂,匀浆后抽提总蛋白或核、膜蛋白。
(2)细胞样品,每份样品取1×106~1×107细胞,用PBS清洗细胞,去PBS加0.1ml-1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂或其它蛋白提取试剂抽提总蛋白或核、膜蛋白。

 

2、蛋白质定量:用Bradford检测或BCA蛋白检测试剂检测蛋白的浓度。
3、变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE),用微量加样枪准确加样到相应的加样孔中,安装电泳分离蛋白。
4、蛋白转移到硝酸纤维膜或PVDF膜上。按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层,30mA恒流条件下,4℃转移过夜。
 
5、膜的封闭和抗体孵育
(1)膜在5%BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非物异结合。
(2)封闭过的膜加入一级抗体室温孵育膜1.5h,抗体抗原结合。
(3)加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准,室温孵育膜1小时,加入HRP标记的GAPDH/b-actin抗体可以同时检测GAPDH/b-actin含量。

6、结果检测:化学发光法检测,膜与化学发光底物孵育,经X光胶片曝光显影。图片扫描保存为电脑文件,并用Image分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化。
7、数据分析:目的蛋白的灰度值除以内参GAPDH/b-actin的灰度值以校正误差,所得结果代表某样品的蛋白相对含量。
8、提供实验报告:包括详细的实验方法及免疫印迹实验结果的相关图片和数据。
 

客户需提供:样本、一抗、阴性、阳性对照和相关文献资料(一抗可由我们代购)。

样品要求:组织100mg以上、细胞106以上,新鲜或冷冻保存。

如何选择和选购抗体——PASS标准

 http://blog.sina.com.cn/s/blog_721358b20100orr8.html

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