SMP检测-高分辨熔解曲线突变检测法

       高分辨熔解(high-resolution melt, HRM)分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的post-PCR技术，不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品基因型的分析。这种方法因其操作简便、快速，结果准确，并且实现了真正的闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。

高分辨率溶解曲线（高分辨溶解曲线突变检测）是理想的SNP检测手段：

Ø    仪器设备—LightScanner Instrument 96；专利的荧光染料技术，专利的高分辨PCR产物溶解曲线基因突变检测（Utah University）技术；LightScanner Call IT软件和专门用于HRM引物设计软件

Ø    快速、高通量—LightScanner 5分钟完成96/384孔板的PCR产物检测， 20000个SNP/天

Ø    准确、灵敏度高、特异性好—LightScanner 100%准确性、特异性（<400bp）；准确性96.4%和特异性99.1%（400~1kb）；肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1%的突变样品基因突变

Ø    重复性好—LightScanner重复性100%

Ø    操作简便—LightScanner只需将PCR产物（96/384孔板）放入仪器内便可，软件自动基因分型

Ø    只检测PCR样品中荧光强度的变化，不消耗任何PCR样品，无污染，PCR产物可以进行下游分析

原理：

       HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。同许多荧光PCR技术一样，HRM是利用了特定的染料可以插入DNA双链中的特性，从而对样品进行检测。随着高精度PCR仪（Rotor-Gene 6000和Lightscanner）和饱和染料（LC Green,Eva green）的出现为HRM这一技术的普及使用成为可能。由于HRM完全是基于核酸的物理性质进行分析，因而无需序列特异性探针。基于这种检测原理，HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规PCR基础上增加一个饱和染料。    

实验流程：

      在PCR反应前将LC Green荧光染料与反应Buffer、引物、模版DNA混合，LC Green染料饱和加入（LC Green荧光染料对PCR不会有任何抑制作用），然后将PCR产物（96孔板或者384孔板）直接放入LightScanner或HR-1仪器中，在一定的温度范围内将PCR扩增产物进行变性，在此期间，仪器的光学检测系统采集密集的荧光信号变化并绘制温度熔解曲线，根据曲线准确区分野生型、杂合突变、纯和突变，软件自动分型。 LightScanner为高通量、高分辨率、高灵敏度检测手段，通过上述检测分型之后，只有约1%的PCR产物需要测序，因此极大的降低了测序的工作量。 

样品要求：

      PCR产物浓度均一，无非特异性扩增，检测片段范围50bp~1000bp。

北京诺赛基因组研究中心有限公司（诺赛基因）是基于基因组学研究的生物高科技企业，公司的发展目标是实现最新生物医药研究成果的产业化。诺赛基因致力于自有知识产权的创新药物的开发，生物标志的鉴定与疾病诊断/预警检测技术的研发，生物制品与试剂的生产，中国人群遗传资源和临床资源的收集、保护、利用与开发，以及生物科技领域相关技术的培训、咨询和服务。

1998年9月，北京诺赛基因组研究中心有限公司由北京生物技术和新医药产业促进中心和北京博大科技投资开发有限公司投资，中国医学科学院/中国协和医科大学、北京大学、中国科学院、军事医学科学院等单位参与组建成立。

诺赛基因开展与人类疾病相关的基因组学、功能基因组学和蛋白质组学研究。1998年10月，国家科技部批准在诺赛基因的基础上成立国家人类基因组北方研究中心，作为国家级研究基地。

诺赛基因自成立以来，整合以北京为中心的科研院所以及临床医院在基因组学及相关领域的科研力量，建立了具有世界级水平的生物学研究实验室，组建了包括8位院士在内的、由26位生物和医药领域资深科学家组成的智囊团，组织并培养了一支由近百名科技人员组成的具有丰富研发经验的科研团队。

诺赛基因现已成功完成和正在进行863、973等国家重点课题及合作项目74项，参与并完成了1%国际人类基因组测序项目，承担了致病微生物基因组测序、中国人群单核苷酸多态性（SNP）检测及疾病基因组学研究等多项国家科研项目。截止目前，诺赛基因已申请专利28族。