大肠杆菌表达纯化服务-原核蛋白表达

  大肠杆菌表达是指通过基因克隆技术，将外源目的基因导入表达菌株，使其在特定条件下进行表达。与其他表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、目的基因表达水平高、培养周期短、抗污染能力强、更易于生长和控制，有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具有各种特性的质粒可供选择等优点。
  E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、渗透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。
  在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录启动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为异乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的作用与异乳糖相同，是一种作用很强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。

实验流程

　　1、原核表达载体构建：目的基因克隆或目的基因合成；限制性内切酶酶切骨架载体并纯化；目的基因插入骨架载体；转化大肠杆菌，筛选阳性克隆并测序鉴定；
　　2、转化表达菌株：针对不同的表达载体选择合适的表达菌株，将目的载体转化到表达菌株内，例如：BL21 (DE3)；
　　3、蛋白诱导表达条件摸索：优化目的蛋白表达条件：IPTG浓度，诱导表达时间，诱导表达温度等；SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；
　　4、扩大培养：选择更佳的诱导表达条件扩大培养物；
　　5、制备表达菌株蛋白提取物：超声波破碎菌体或者高压破碎菌体；
　　6、目的蛋白的纯化：亲和纯化；SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western Blot检测。
 

　　服务周期短；
　　目的蛋白纯度高；
　　目的蛋白可溶性高；
　　多种表达菌株以及载体可供选择；
　　团队经验丰富