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从新鲜样本到FFPE样本，空间转录组测序已经把可用有意义的临床样本更大程度地利用到疾病的研究中。
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从新鲜样本到FFPE样本，空间转录组测序已经把可用有意义的临床样本更大程度地利用到疾病的研究中。然而，在实际的实验过程中，新鲜包埋样本或者FFPE样本的一些本身问题和技术平台的限制，导致我们理想中的空间转录组测序并不是一帆风顺。
之前的Visium新鲜样本实验需要对术后的样本进行及时冰冻包埋，且组织截面积大小不能超过6.5*6.5mm的芯片规格，对冰冻样本的RNA质检结果需要达到RIN值7以上。同时，该实验需要一次性同时做4个矩阵，即需满足4个样本切片，样本质检的透化预实验时间还需比较接近。
之前的Visium FFPE实验需要将石蜡样本进行切片，贴片到Visium芯片并经过质检及粘附性测试后，才能进行后续实验，对样本质量要求较高。在实验中经常会面临以下问题：（1）无法转移已经贴片到普通玻片的稀有样品；（2）无法只针对感兴趣的区域进行分析；（3）6.5*6.5mm的芯片规格无法一次性对大面积的组织进行分析；（4）石蜡样本保存时间过长，质检不合格或切片过少，不满足粘附性测试；（5）石蜡样本不允许带出医院等。
针对上述问题，10x Genomics推出了全新的Visium CytAssist空间转录组，能够直接将新鲜冰冻样本、FFPE组织切片上的转录组和蛋白质分析物从标准的组织学载玻片转移到Visium玻片上，无需进行多次切片贴片及粘附性测试实验，极大的简化了样本的处理。
产品特点
● 兼容样本类型更丰富：适用于新鲜样本、普通石蜡块组织、存档的玻片样本、已经通过H&E染色或者免疫荧光染色贴在普通玻片上的样本等；
● 简化样本处理：直接将转录组分析物从标准载玻片转移到Visium玻片的捕获区域；
● 样本质量要求降低：DV200 > 30% 即可进行后续实验；
● 高灵敏度：独特的RTL探针设计，每个基因设置1~3对捕获探针，高特异性、高灵敏地捕获所有基因；
● 芯片配置更灵活：兼具 6.5*6.5 mm和 11*11 mm两种规格，较大组织也可一次性完成检测，适用于更多组织类型；
● 获得更多的空间见解：通过标准的组织学技术预先筛选组织切片，选择出最有生物学意义的切片；
● 缩短实验周期：使用CytAssist专用玻片和试剂，每次运行可从最多两张FFPE组织切片中精确捕获分析物，而时间不到一小时；
● 多组学分析：提供商业化的35种蛋白组合试剂盒，可以对同一FFPE样本进行转录组和蛋白质的同时分析，对基因表达检测的同时检测几十种蛋白。
CytAssist空间转录组测序实验流程及捕获芯片设计
在VisiumﾠCytAssist流程中，切片、脱蜡以及染色和成像（H&E或IF）的步骤是在标准载玻片上进行的。在探针杂交后，将两张标准载玻片和一张含两个捕获区域的Visium玻片放入CytA ssist仪器中，让标准载玻片上的组织切片与两个Visium捕获区域的顶部对齐，并通过 Visium CytAssist 仪器捕捉明场图像，确定感兴趣的病理区域；接着，运行VisiumCytAssist 仪器将普通玻片组织切片上选定目标区域的探针原位转移到 Visium 捕获区，Visium 捕获区域通过带有不同位置标签的探针捕获转录组信息（探针释放和捕获），从而获取石蜡切片不同空间位置的转录表达水平。其余步骤（从探针延伸开始）按照Visium FFPE标准流程在仪器外进行。
CytAssist空间转录组设计了两种规格的捕获芯片，分别为大小为6.5*6.5mm以及11*11mm的捕获点阵。每个点阵上包含有55μm直径，间距100μm的携带空间Barcodes和UMI，Poly(dT)的探针群。每张芯片可同时进行2张组织切片的检测。
CytAssist空间转录组测序捕获芯片设计
常规 Visium vs CytAssist
研究领域
空间转录组一站式解决方案
空间转录组数据分析流程
● BayesSpace：增加空间分辨率
BayesSpace，一种完全贝叶斯统计方法，通过使用来自空间邻域的信息来增强空间转录组数据的分辨率并进行聚类分析，能够有效识别具有相似表达谱的空间簇以及提高空间转录组学分辨率。
● CellTrek：根据scRNA-seq和ST数据直接将单个细胞映射到组织切片的空间坐标SPOTlight：
● Cell2location：将单个细胞参考细胞类型映射到空间转录组数据集
● SPOTlight：识别每个spot中的细胞类型和比例
实验设计
案例分析（二）
实验设计
对于FFPE样本，请在制备和保存FFPE样本过程中，尽可能减少因固定包埋操作而引起RNA/DNA/蛋白质量下降。目前Visium for FFPE 检测，对组织的固定包埋方法不做限制。在最后石蜡包埋步骤，建议使用组织包埋盒（图示），在包埋过程中承载组织样本，以便进行包埋、组织切片和安全存放。
之前的Visium新鲜样本实验需要对术后的样本进行及时冰冻包埋，且组织截面积大小不能超过6.5*6.5mm的芯片规格，对冰冻样本的RNA质检结果需要达到RIN值7以上。同时，该实验需要一次性同时做4个矩阵，即需满足4个样本切片，样本质检的透化预实验时间还需比较接近。
之前的Visium FFPE实验需要将石蜡样本进行切片，贴片到Visium芯片并经过质检及粘附性测试后，才能进行后续实验，对样本质量要求较高。在实验中经常会面临以下问题：（1）无法转移已经贴片到普通玻片的稀有样品；（2）无法只针对感兴趣的区域进行分析；（3）6.5*6.5mm的芯片规格无法一次性对大面积的组织进行分析；（4）石蜡样本保存时间过长，质检不合格或切片过少，不满足粘附性测试；（5）石蜡样本不允许带出医院等。
针对上述问题，10x Genomics推出了全新的Visium CytAssist空间转录组，能够直接将新鲜冰冻样本、FFPE组织切片上的转录组和蛋白质分析物从标准的组织学载玻片转移到Visium玻片上，无需进行多次切片贴片及粘附性测试实验，极大的简化了样本的处理。
产品特点
● 兼容样本类型更丰富：适用于新鲜样本、普通石蜡块组织、存档的玻片样本、已经通过H&E染色或者免疫荧光染色贴在普通玻片上的样本等；
● 简化样本处理：直接将转录组分析物从标准载玻片转移到Visium玻片的捕获区域；
● 样本质量要求降低：DV200 > 30% 即可进行后续实验；
● 高灵敏度：独特的RTL探针设计，每个基因设置1~3对捕获探针，高特异性、高灵敏地捕获所有基因；
● 芯片配置更灵活：兼具 6.5*6.5 mm和 11*11 mm两种规格，较大组织也可一次性完成检测，适用于更多组织类型；
● 获得更多的空间见解：通过标准的组织学技术预先筛选组织切片，选择出最有生物学意义的切片；
● 缩短实验周期：使用CytAssist专用玻片和试剂，每次运行可从最多两张FFPE组织切片中精确捕获分析物，而时间不到一小时；
● 多组学分析：提供商业化的35种蛋白组合试剂盒，可以对同一FFPE样本进行转录组和蛋白质的同时分析，对基因表达检测的同时检测几十种蛋白。
CytAssist空间转录组测序实验流程及捕获芯片设计
CytAssist空间转录组测序实验流程
在VisiumﾠCytAssist流程中，切片、脱蜡以及染色和成像（H&E或IF）的步骤是在标准载玻片上进行的。在探针杂交后，将两张标准载玻片和一张含两个捕获区域的Visium玻片放入CytA ssist仪器中，让标准载玻片上的组织切片与两个Visium捕获区域的顶部对齐，并通过 Visium CytAssist 仪器捕捉明场图像，确定感兴趣的病理区域；接着，运行VisiumCytAssist 仪器将普通玻片组织切片上选定目标区域的探针原位转移到 Visium 捕获区，Visium 捕获区域通过带有不同位置标签的探针捕获转录组信息（探针释放和捕获），从而获取石蜡切片不同空间位置的转录表达水平。其余步骤（从探针延伸开始）按照Visium FFPE标准流程在仪器外进行。
CytAssist空间转录组设计了两种规格的捕获芯片，分别为大小为6.5*6.5mm以及11*11mm的捕获点阵。每个点阵上包含有55μm直径，间距100μm的携带空间Barcodes和UMI，Poly(dT)的探针群。每张芯片可同时进行2张组织切片的检测。
CytAssist空间转录组测序捕获芯片设计
常规 Visium vs CytAssist
研究领域
空间转录组一站式解决方案
空间转录组数据分析流程
空间转录组数据分析展示-基础分析
空间转录组数据分析展示-高级分析
● Spatial PCA：增加空间聚类准确性
Spatial PCA是一种空间的降维方法，建立在PCA的基础上，将定位信息作为额外的输入，并使用核矩阵来明确地模拟不同组织位置的空间相关结构。
Spatial PCA是一种空间的降维方法，建立在PCA的基础上，将定位信息作为额外的输入，并使用核矩阵来明确地模拟不同组织位置的空间相关结构。
● BayesSpace：增加空间分辨率
BayesSpace，一种完全贝叶斯统计方法，通过使用来自空间邻域的信息来增强空间转录组数据的分辨率并进行聚类分析，能够有效识别具有相似表达谱的空间簇以及提高空间转录组学分辨率。
● CellTrek：根据scRNA-seq和ST数据直接将单个细胞映射到组织切片的空间坐标SPOTlight：
● Cell2location：将单个细胞参考细胞类型映射到空间转录组数据集
● SPOTlight：识别每个spot中的细胞类型和比例
官方测试数据
● 更高的检测深度
使用CytAssist的组织测序数据的利用率更高，获得更多的差异表达基因数量，从而获取更多有意义的信息。
● 更高的检测深度
使用CytAssist的组织测序数据的利用率更高，获得更多的差异表达基因数量，从而获取更多有意义的信息。
● 更高的覆盖率（更多的转录组被探针集覆盖）和灵敏度
对于人类卵巢癌，CytAssist的数据显示了更高的敏感性和覆盖率，同时保持了可比性的整体空间组织。
对于人类卵巢癌，CytAssist的数据显示了更高的敏感性和覆盖率，同时保持了可比性的整体空间组织。
● 更明确的空间聚类结果
更高的测序深度CytAssist处理的小鼠脾组织具有更明确的空间聚类，个体标记物分布更清晰。
更高的测序深度CytAssist处理的小鼠脾组织具有更明确的空间聚类，个体标记物分布更清晰。
● 适用于多个领域的研究
辅助识别免疫细胞以及神经细胞群等，适用于多领域研究。
辅助识别免疫细胞以及神经细胞群等，适用于多领域研究。
案例分析（一）
● 空间转录组学分析损伤后小鼠肠道的愈合情况
发表杂志：Nature communications
影响因子：17.694
发表时间：2022.2
发表杂志：Nature communications
影响因子：17.694
发表时间：2022.2
实验设计
本研究使用10xﾠVisium空间转录组测序平台对小鼠冷冻结肠进行实验，以研究稳态和黏膜愈合状态下的小鼠结肠空间转录组的改变。结果在稳态结肠中识别以前未被重视的结肠分子区域化水平。同时利用与人类IBD患者疾病结果相关基因的靶向定位和全基因组关联研究（GWAS），分析了IBD的风险变异及特异性病理过程。总之，本研究首次绘制了健康和受伤后恢复状态下小鼠整个肠道的基因表达图谱，揭示了单个基因在组织中的表达位置。
案例分析（二）
● 单细胞联合空间转录组分析揭示异常淋巴发育程序驱动肉芽肿形成
发表杂志：Immunity
影响因子：43.474
发表时间：2023.2
发表杂志：Immunity
影响因子：43.474
发表时间：2023.2
实验设计
本研究通过结合单细胞测序和空间转录组学，对结节病患者的肉芽肿进行研究。通过生物信息学方法重建潜在的基因调控网络，发现了一种免疫刺激环境—重新利用与淋巴器官发育相关的转录程序。三种细胞类型在肉芽肿的形成中起着关键作用，包括：巨噬细胞、Th17.1细胞和成纤维细胞。在结节病小鼠模型中，靶向基质金属蛋白酶药理学抑制减弱了肉芽肿的形成。总之，本研究表明，人类肉芽肿在异常组合中具有正常淋巴器官发育的特征，产生了一种异常形式的TLSs。
组织包埋经验分享
对于新鲜组织，建议将预冷好的OCT填充入冷冻模具的底部（可做好标记，以确认组织方向），然后用镊子迅速将冰冻好的组织（新鲜组织浸入已液氮浴预冷的CH3CH2CH-(CH3)2中进行冷冻处理，若无此条件也可以新鲜组织直接进行包埋操作）放入，并用OCT覆盖组织，使之完全包埋住。该过程应避免产生气泡。然后立即将冷冻磨具转移到粉末状干冰上。当OCT变得完全不透明，包埋成功。对组织进行修理，去掉多余部分，留下需要的组织块。最后，包埋好的组织块可放在干冰上运输至-80°C进行储存。
组织包埋经验分享
对于新鲜组织，建议将预冷好的OCT填充入冷冻模具的底部（可做好标记，以确认组织方向），然后用镊子迅速将冰冻好的组织（新鲜组织浸入已液氮浴预冷的CH3CH2CH-(CH3)2中进行冷冻处理，若无此条件也可以新鲜组织直接进行包埋操作）放入，并用OCT覆盖组织，使之完全包埋住。该过程应避免产生气泡。然后立即将冷冻磨具转移到粉末状干冰上。当OCT变得完全不透明，包埋成功。对组织进行修理，去掉多余部分，留下需要的组织块。最后，包埋好的组织块可放在干冰上运输至-80°C进行储存。
对于FFPE样本，请在制备和保存FFPE样本过程中，尽可能减少因固定包埋操作而引起RNA/DNA/蛋白质量下降。目前Visium for FFPE 检测，对组织的固定包埋方法不做限制。在最后石蜡包埋步骤，建议使用组织包埋盒（图示），在包埋过程中承载组织样本，以便进行包埋、组织切片和安全存放。
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