非洲猪瘟病毒检测整体解决方案

1.常见样本类型：
分泌物、血液、脾脏、扁桃体、肾脏和淋巴结等样本中的非洲猪瘟。
 
 
2.. 样品预处理方式（样本处理区）
2.1 样本前处理
2.1.1组织样品：每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取
0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心2min，取上清液 200μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；
2.1.2全血样本：取全血 200μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。
相关实验设备：动物组织研磨仪、手持式电动组织研磨仪

根据样本数量多少可用高通量组织破碎仪或者手持式组织研磨仪破碎组织样本，之后用离心机将样本离心分层，取上清液。
2.2样本保存和运输
上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。
 
2.3 DNA 提取
对上述处理好的标本加入到预装好提取试剂的96深孔板中，将加好样本的耗材放置到96全自动核酸提取仪中提取核酸。
 
96全自动核酸提取仪用于病毒核酸的提取，配套提取试剂可以以散装形式提供，也可以以预装的形式提供，96高通量移液工作站可以用于散装试剂的分装。

 
3. 试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，将上游引物、下游引物、荧光定量探针、酶液预混好，将混合好反应液分装到 PCR 反应管中。

试剂	用量
非洲猪瘟病毒荧光PCR引物探针Mix	1.6 uL
非洲猪瘟病毒荧光PCR Premix	10 uL
提取样品ＤＮＡ	2 uL
RNase free H2O	6.4 uL
反应总体积	20 uL

 
 

 
 
 
 
根据样本的多少可以选用96高通量移液工作站或移液排枪进行体系的配置和分装。
 
4. 加样（样本处理区）
将提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取一定量，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

 
 
 
 
 
 
5. PCR 扩增（核酸扩增区）
5.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
5.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 20μL；
荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。
5.3 相关设备：
ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

 
 

• 若使用ABI 7300 PCR 仪，每个反应需要加入0.4 uL的ROXⅠ（终浓度为1X）
• 若使用ABI 7500 PCR仪，每个反应需要加入0.2 uL的ROX Ⅱ（终浓度为0.5X）

PCR 反应循环条件设置

步骤	循环数	温度	时间	荧光通道
1	1	95	0:30
2	40	95	0:10
		60	0:34	收集FAM荧光

 
 
6. 结果分析判定
6.1 结果分析条件设定
设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

 
 

无锡百泰克生物技术有限公司位于太湖明珠-江苏无锡，是一家专业型的高科技生物技术企业。公司致力于研究分子诊断和快速检测业务，尤其在核酸提取方面成绩卓著。公司现有办公区域、生产基地面积超50000平米。经不断努力，截至2022年，无锡百泰克生物科技有限公司拥有48项授权专利，并通过了ISO13485质量管理体系认证。

新冠疫情爆发后，百泰克迅速投身全球抗疫事业，坚守抗疫一线并推出系列检测产品，其产品高效与稳定性受到国内外广泛认可。