原位杂交

    原位杂交组织(或细胞)化学 (In situ Hybridization Histochemistry, ISHH) 简称原位杂交(In Situ Hybridization)，属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。

    原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。

服务流程：

1. 根据客户送的样本（固定好或者包埋好），以及样本类型，安排实验

2.包埋或者切片后，根据客户所测指标，设计特异性探针，标记示踪物。然后进行一系列反应。

3.（可选）根据上述所做好的切片进行拍片，分为荧光显微镜（激光共聚焦显微镜）或普通光学显微镜

4.（可选）针对做好的玻片进行分析，分析时选取较好的区域，分析三个视野

5.提供实验报告：包括详细的实验方法及原位杂交实验结果的相关图表 

操作步骤：

   取材：
    ● 0.1M PBS (pH 7.2) 浸 5-10min。
    ● 0.1M甘氨酸/0.1M PBS 浸5min。
    ● 0.3%TritonX-100/0.1M PBS 浸10-15min。
    ● 0.1M PBS 洗 5min×3次，加蛋白酶K(1μg/ml)，37℃孵育30 min。
    ● 4%多聚甲醛浸5min。
    ● 0.1M PBS 洗 5min×2次，浸入新鲜配制的含0.25%乙酸酐/0.1M三乙醇胺中10min。
    预杂交：滴加适量预杂交液，42℃ 30 min。
    杂交：倾去预杂交液，在每张切片上滴加10-20μl杂交液（将探针变性后稀释在预杂交液中，0.5 ng/μl ），覆以盖玻片或蜡膜，42℃ 过夜。（阴性对照）
    洗片：(1) 4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20min；0.2×SSC 37℃洗10min；0.2×SSC与0.1M PBS各半洗10min；0.05M PBS 洗 5min×2次。
    ● 3% BSA/0.05M PBS 包被，37℃ 30min.
    ● 滴加抗-抗血清碱性磷酸酶复合物（以抗体稀释液1:5000稀释）4℃孵育过夜。
    ● 0.05M PBS洗15min×4次; TSM1 10min×2次; 新鲜配制TSM2 10min×2次。
    显色：在玻片上滴加适量显色液，4℃避光过夜。
    ● 将玻片置于TE中10-30min以终止反应。
    ● 酒精梯度脱水、二甲苯脱脂。
    ● 中性树胶封片，显微镜下观察结果

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