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高通量测序（High-Throughput Sequencing）又名下一代测序（Next Generation Sequencing
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高通量测序
高通量测序（High-Throughput Sequencing）又名下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS），是相对于传统的桑格测序（Sanger Sequencing）而言的。高通量测序是DNA测序发展历程的一个里程碑，可一次对几十万到几百万条 DNA 分子进行序列测定，因其具有可对完全序列未知的样本进行直接测序的特点，使得研究者对一个物种的转录组和基因组进行细致全面的分析成为可能，所以又被称为深度测序 (deep sequencing) 。目前高通量测序的主要平台代表有罗氏公司(Roche)的454测序仪（Roch GS FLX sequencer），Illumina公司的Solexa基因组分析仪（Illumina Genome Analyzer）和ABI的SOLiD测序仪（ABI SOLiD sequencer）。
随着高通量测序技术的迅猛发展，NGS技术开始越来越多地被应用来解决生物学问题。比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行从头测序（de novosequencing），获得该物种的参考序列，为后续研究和分子育种奠定基础；对有参考序列的物种，进行全基因组重测序（resequencing），在全基因组水平上扫描并检测突变位点，发现个体差异的分子基础。在转录组水平上进行全转录组测序（whole transcriptome resequencing），从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性（cSNP）等研究；或者进行小分子RNA测序（small RNA sequencing），通过分离特定大小的RNA分子进行测序，从而发现新的microRNA分子。在转录组水平上，与染色质免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技术相结合，从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。
一、威斯腾测序平台：
基于创新的 Illumina 的 Hiseq2000 、 Genome AnalyzerIIx 与 Roche 454 的高通量测序平台，威斯腾生物可帮助您对样本的 microRNA 、 mRNA 、 ncRNA 或 DNA 在进行各种预处理 ( 片段化与建库 ) 后进行高通量的测序。根据样本 RNA 或者 DNA 的不同应用可分为转录组测序、 microRNA测序、 ncRNA测序、基因组测序等。
图 1 Illumina Hiseq2000
图2 Roche GS Junior System
二、服务种类：
1、基因组测序
1）人类基因组重测序
2）动植物基因组测序（de novo）及重测序
3）细菌基因组测序（de novo）及重测序
4）真菌基因组测序（de novo）及重测序
2、转录组测序
1）真核转录组
2）细菌转录组
3）数字表达谱分析
4）MicroRNA测序
5）降解组测序分析
3、转录因子结合位点的检测
4、特定区域测序
5、目标序列捕获测序
6、ChIP-seq 测序服务
7、甲基化测序
三、服务内容：
1、基因组测序:
全新物种基因组测序：对全新的微生物、植物或动物物种基因组进行整体揭示，包括片段测序、序列组装、基因预测与注释等环节，可以从整体水平对目标物种进行研究。
基因组重测序：全基因组重测序是对已知基因组序列的物种的个体进行测序，并在个体或群体水平进行差异分析的方法。如微生物的不同菌株、不同疾病患者、不同表型个体等的基因组测定及与已有标准基因组进行比较分析。
2、转录组测序:
特定组织或者细胞中的 mRNA 经分离后制备成片段化的 cDNA 文库，通过 Illimina 测序仪对 cDNA 文库高通量测序，从而获得一个细胞或生物个体的全转录组信息，用于寻找差异表达基因与可能的新的可变剪接形式。
3、microRNA 与 ncRNA 测序 :
可对细胞或者组织中的全部 Small RNA 或 Noncoding RNA 进行深度测序及定量分析。用于作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、表达谱分析、miRNA 或 ncRNA 聚类等科学应用。
四、实验步骤及品控
1、实验步骤（以基因组测序为例）：
实验方案确定
↓
基因组DNA的随机打断
↓
DNA片段的末端修复
修饰，末端加上接头(adapter)
↓
↓
PCR扩增连上接头的DNA片段
↓
文库检测
↓
DNA的成簇扩增
↓
上机测序
↓
生物信息组装/分析
2、品质保证：
1）全程采用 Illumina 或 Roche 标准试剂；
2）严格各环节质控，包括 RNA 电泳、基于 Nanodrop 与 Angilent Bioanalyzer 的 RNA 分析、库指标、测序数据质量等
3）按客户需求严格保证数据总量与质量，并配以完备的数据分析服务。
五、样品要求：
1、动物、植物、微生物组织：
提供足量的新鲜柔嫩部位样品；新鲜程度要求：采样后将样品立即液氮速冻－80℃保存（保存期不超过1个月），干冰运输，样本保存期间切忌反复冻融。
2、RNA样品
总RNA＞500ug，浓度＞1ug/ul；
mRNA＞3ug，浓度＞50ng/ul；
OD260/OD280为1.8-2.0；
3、DNA样品
OD260/280为1.8-2.0之间；样品浓度越高越好，最好不应低于30ng/ul，总量不低于20ug；基因组需保证完整，无明显降解。
六、结果提交：
1、原始数据报告，包含所有测序序列的序列信息，碱基读取质量评估。
2、基本数据分析报告（Excel表格），包含有效序列的序列信息
3、高级数据分析（应客户要求定制）
1）基因组组装：包括原始数据统计、覆盖度计算、组装结果相关统计；
2）基因组组分分析：编码基因预测，以及基因功能预测；
3）比较基因组分析：以客户提供的近源物种的序列为参考序列，进行SNP分析、共线性分析。
图3：第二代测序工作流程图
图4：沙门氏菌 SL1344 基因组注释简图
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