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全自动系统Wes助力默克公司鉴定纳米抗体ADA
点击次数:1605 发布日期:2020-7-27  来源:本站 本站原创,转载请注明出处

默克公司PPDM ADME Biologics部门利用全自动Western blot系统Wes,研究纳米抗体早期ADA免疫原性评估,文章发表在Journal of Pharmacological and Toxicological Methods:A capillary electrophoresis based approach for the identification of anti-drug antibodies against camelid VHH biologics (Nanobodies®), J Pharmacol Toxicol Methods. May-Jun 2020;103:106872.
 

--研究背景--

纳米抗体(Nanobody)除了由包含两个重链和两个轻链的四个亚基组成的正常异四聚体抗体以外,骆驼科动物会产生独特的仅重链的抗原结合蛋白,其单个可变域(VHH)大小约为15kDa。纳米抗体是分离的VHH结构域,可以与短肽序列连接在一起,形成具有多对位或多特异性结合特性的多价模块化构建体。因此,纳米抗体被评估为潜在的生物治疗方法。
 

抗药物抗体(Anti-drug-antibody,ADA):蛋白质类药物的特异性,以及可调节的定位和靶向特性极大的改变了原有的药物临床使用领域。但基于蛋白质本身独特的复杂性,其药物制剂势必会具有引起抗药物抗体应答(ADAs)的潜力。而ADA的产生,对药物暴露、药物毒性作用、药物代谢动力学、药物效应动力学造成影响,甚至导致不良的安全后果。因此,对于ADA免疫原性评估在确定生物候选药物的最终临床成功方面非常重要。


因此,默克公司利用ProteinSimple公司的全自动Western Blot系统Wes(可以高灵敏度和高精度地定量靶蛋白的水平),开发了一种WESADA平台,用于评价纳米抗体(Nb)药物开发过程中ADA的评估。


ProteinSimple公司Wes工作原理


--研究内容--

纳米抗体XYZ构型

纳米抗体X:由5个VHH组成:A,B,C,D和E。

纳米抗体Y:由2个NHH组成:B和E。

纳米抗体Z:由3个NHH组成:A,C和E。

A和B:两种不同的抗鼠淋巴细胞激活基因3(LAG3)的VHH。

C和D:两种不同的抗鼠编程性细胞死亡蛋白1(PD1)的VHH。

E:结合白蛋白的VHH,用于延长半衰期。

相同的35个氨基酸的GS-接头连接所有VHH。 

纳米抗体X滴度测定


为了确定固定在毛细管中的有效纳米抗体浓度,以纳米抗体X作为样本,进行2倍稀释(从80降至1.25μg/mL)进行上样,以两个ADA阳性样品和抗纳米抗体mAb1作为一抗,进行检测。最终选择20μg/mL作为所有毛细管固定的纳米抗体的默认浓度。


WESADA更宽的动态信号范围
 


将WESADA动态范围与其他两个常用的ADA分析平台进行了比较:1)MSD平台2)Gyros。为了在所有三个平台上进行比较,要求最小的信噪比等于或高于10。如图所示(▲:WESADA),WESADA平台展示了更宽的动态范围。


ADA信号滴定


WESADA信号用两种ADA阳性样品E和8的不同浓度进行滴定。当纳米抗体浓度固定时,ADA阳性样品E在5120倍稀释因子时有信号,而样品8在1280倍稀释因子才有信号。表明小鼠样品E的ADA滴度比样品8高。


WESADA信号的特异性


为了确认WESADA信号的特异性,将ADA阳性的小鼠样品与500μg/mL天然纳米抗体预孵育,再与纳米抗体X反应。结果显示,所有ADA阳性小鼠血清样品和阳性对照抗纳米抗体mAb1的AUC均降低61%至100%。证明了ADA对天然纳米抗体X的特异性。


WESADA同时对每个毛细管的多个目标进行ADA分析


为了测试WESADA同时进行ADA分析的可行性,将NanobodyX(5个VHH模块)单独上样,或者与NanobodyY(3个VHH模块)共同上样,跑胶后固化在毛细管上。再运行5种小鼠ADA阳性血清样品作为一抗进行检测。如图所示,WESADA可用于同一毛细管中固定多个纳米抗体来检测ADA。


多聚纳米抗体的ADA特异性分析



利用WESADA检测来确定哪些VHH模块负责检测到的ADA信号。给予纳米抗体X(模块A,B,C,D,E)的小鼠表现出很强的ADA反应,而给予纳米抗体Z(模块A,C,E)的小鼠表现出相对较低的信号反应。这表明模块B或D可能是针对纳米抗体X观察到的ADA信号的原因。为了测试这种可能性,选择5种针对纳米抗体X的ADA信号最强的血清样品(小鼠1,2,4,5,8,在图中标有*),对5种模块进行单独检测。结果显示,五分之四样品显示模块B的反应较高,而对模块A,C,D,E的信号则低至无法检测到。这表明模块B主要负责针对纳米抗体X的ADA响应。


结论:


蛋白类药物的不良免疫反应可能会对药物的药代动力学,功效和安全性产生不利影响。而抗药物抗体(ADA)的存在已成为免疫原性应答的关键决定因素。本文利用ProteinSimple的Wes系统建立了WESADA平台。可以对ADA的阳性样品进行鉴定,同时可以确定多价纳米抗体构建物中的哪个VHH模块刺激了主要的ADA反应。同时还允许对同一实验样品中具有不同分子大小的多个目标同时进行ADA分析。这种基于毛细管电泳的方法可对样品进行快速分析,而无需单独定制优化或试剂标记,同时只需消耗少量样品和药物。因WESADA检测到的任何ADA信号都可以与毛细管中药物的预期分子量大小相关,从而排除了非特异性结合,提供了信号对药物具有特异性的额外置信度。预示着WESADA平台有助于在蛋白类药物早期开发阶段对大量实验性候选药物进行便捷的免疫原性评估。
 

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相关公司:美国ProteinSimple公司
联系电话:021-60276091
E-mail:Qian.Su@bio-techne.com


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