mRNA作为一种新型的疫苗和药物形式，为疾病的预防和治疗带来了新的希望。随着mRNA疫苗被成功用于COVID-19的预防，国内外针对各类传染病、肿瘤、罕见病、自身免疫疾病等疾病的预防类疫苗或治疗性药物的研究也在如火如荼地进行。在mRNA疫苗的研发及生产过程中，涉及对mRNA原料药特性、纯度、数量、物理状态（完整性）和安全性等多方面的质量评估，其中对mRNA完整性的评估是至关重要也是必须的步骤。

近日，中国国家药品监督管理局药品审评中心发布的《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）》中指出“应选用可充分鉴别产品相关杂质（截短mRNA、长RNA、双链RNA等）且具有足够灵敏度的检测方法对原液、制剂等不同阶段mRNA序列的完整性和纯度予以确认和控制，如毛细管电泳等。”

美国药典（USP）关于“Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality” 的指导草案中也推荐使用毛细管凝胶电泳对mRNA完整性进行质控，其中推荐了Agilent System并详述了其实验方法。
   

问  USP指导草案中推荐的Agilent System毛细管电泳系统是啥？ Agilent Fragment Analyzer 自动毛细管电泳系统采用12/48/96多道并行毛细管电泳的原理，一次可上样三块96孔板，可自动连续运行288个样品。为您提供方便的、可靠的、一致的、高通量、低成本的mRNA质量评估。
     
问  谁在用Agilent Fragment Analyzer做mRNA疫苗质控？
 
我们在辉瑞/BioNTech公司接受美国CBS电台关于“How the Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine was developed”的采访视频中看到了Agilent（原Advanced Analytical）Fragment Analyzer的身影。
 
BioNTech的研究者于2021年发表在Nature的文章中也提到采用Agilent Fragment Analyzer毛细管电泳系统进行mRNA完整性评估。
     
国内众多不便透露名字的企业和质检部门也在其mRNA疫苗或药物研发及质量评价流程中使用Agilent Fragment Analyzer毛细管电泳系统进行mRNA完整性的评估。
 
问  Agilent Fragment Analyzer在mRNA质量评估中的表现如何？
 
1  准确的、高重复性的片段大小结果
采用Agilent 5200 Fragment  Analyzer对浓度分别为1ng/μL、10ng/μL、50ng/μL、100ng/μL，理论长度分别约为1,800nt 和 6,039nt 的  IVT（In vitro transcription ）mRNA进行分析，结果显示测得的平均片段长度分别为1,836nt和6,503 nt（见图1和2），%CV和%Error均较低（见表1），结果表现出高度一致性和准确性。
       

2  可检测长达9,000nt甚至更长的mRNA
在Agilent 5200 Fragment  Analyzer上采用extended RNA method结合专门的Long RNA Ladder可实现对长达9,000nt甚至10,000nt的mRNA进行准确的片段大小的分析。
        
3  准确表征mRNA的降解程度
Agilent Fragment  Analyzer自带ProSize 分析软件，用户可通过Smear分析批量计算符合要求的RNA片段的百分比或降解的RNA的百分比。
 
对长度为9000nt的IVT mRNA进行不同时长的70℃孵育以获得不同程度降解的mRNA样品，通过Agilent 5200 Fragment Analyzer system进行检测，结果表明Fragment Analyzer可以准确表征mRNA的降解程度。
 
峰图和凝胶图结果显示，随着加孵育时间的增加，9,000nt以上的片段逐渐减少，9,000nt以下的弥散条带逐渐增多。
 
 
通过Prosize软件进行计算，结果显示75-7,500nt以下的片段百分比逐渐增多，7,500-11,000nt以上的片段百分比逐渐减少，与预期结果一致。
   
4  可用于更多的mRNA疫苗评估环节
Agilent 5200 Fragment  Analyzer还可以进行IVT mRNA纯度的检测如是否含有未完全转录的DNA模板、PolyA尾长度表征等。