赛多利斯BLI技术助力2021诺奖得主揭示“痛觉感知”

近日，David Julius和Ardem Patapoutian因发现温度和触觉感受器而被授予2021诺贝尔生理学或医学奖。David Julius团队在感觉神经纤维上发现了被热、冷或化学刺激物激活的离子通道，提供了对热感觉、疼痛和瘙痒过程的分子级洞察。离子通道是一类物质交换的膜蛋白，其中有一种TRPA1离子通道，又称芥末受体（wasabi receptor），是特异表达于初级传入神经元（感觉神经元）上的跨膜受体。记得第一次吃芥末的那种酸爽吗？就是它的作用! 更关键的是TRPA1被认为是治疗慢性疼痛和瘙痒的潜在靶点。
   
2019年David Julius课题组在《Cell》杂志发表题为A Cell-Penetrating Scorpion Toxin Enables Mode-Specific Modulation of TRPA1 and Pain的文章，找到了来自于澳大利亚黑石毒蝎毒液的一种特异高效的TRPA1激动剂，并揭示了其作用机理，这种激动剂是被称之为“芥末受体毒素”（WaTx）的多肽。
 
激动剂WaTx的结合机理
脂质体融合实验发现WaTx能够深入细胞膜，与TRPA1的胞内段结合。那结合位点在哪里呢？NMR结构解析发现，TRPA1胞内段还真的有一个口袋可能结合WaTx（如图1所示）。
   
离子通道与拮抗剂/抑制剂（可能是一种毒素或者药物）的相互作用是揭示其机理重要的一步，而BLI（生物层干涉）技术是最直接的检测两者相互作用的方法，使用BLI技术检测WaTx和TRPA1的互作是必要的。
 
不过问题又来了，离子通道蛋白是一种膜蛋白，其表达纯化一般很困难，即使能表达也只表达某一段（比如胞外段）。并且膜蛋白的缓冲液也是比较苛刻的，一不小心就全军覆没。如果能用膜提取物取代纯化的蛋白做相互作用，就可以解决很多包括各种膜受体和离子通道的亲和力检测问题了。赛多利斯Octet®分子互作分析系统基于BLI技术，能够检测浓度很低的TRPA1粗提物。
 
使用Octet®检测TRPA1粗提物
作者在用BLI检测前，先算了一笔账，如果细胞的浓度为2×10⁶/mL，一个细胞上大概有1000个离子通道。那么阿伏伽德罗常数一除，这些细胞悬浮液的膜提取物中TRPA1的浓度约为 (2×10⁶×1000×1000)/(6.02×10²³) = 3.3×10⁻¹²，大概为pM级别。考虑到膜提取的损失，就定为1 pM吧。这些数字不是拍脑袋想出来的，是通过电生理方法验证过的。即使在如此低的浓度下，只要亲和力高，用Octet®也是可以检测出来的。
作者用SA（链霉亲和素）传感器固化Biotin-GSGS-WaTx，然后与表达人TRPA1细胞的膜提取物（总蛋白浓度为0.5 mg/mL）结合解离，结果如图2所示：
  如果设定TRPA1的浓度为1 pM，KD值为0.33 pM。可见，亲和力是非常高的，说明WaTx可以和TRPA1在体外发生直接而牢固的相互作用。
 
动物实验证明了WaTx导致了因受体活化而引起的钙离子通透性降低，从而抑制了神经多肽CGRP的释放，也因此阻断了神经炎症的发生。
 
这位诺贝尔奖获得者为什么会使用Octet®呢？

• 非标记Direct binding是趋势，它的结果更准确
• 快速测定亲和力，更好地对互作进行定量表征
• 使用浸入即读的检测模式，相对于传统仪器，不受微流路限制，对粗样品耐受性高，本文就是膜提取粗样品
• 列入《美国药典》的分子互作分析方法，文章多，认可度广
• 使用方便，成本相对低

 
当然2020年两位诺贝尔奖获得者也用到了Octet®，请看下面链接。
告别EMSA，试试CRISPR女神用的核酸互作神器
诺奖获得者教你做分子互作竞争实验

参考文献
A Cell-Penetrating Scorpion Toxin Enables Mode-Specific Modulation of TRPA1 and Pain . Cell，2019