伯豪甲基化及焦磷酸测序助力皮肤病领域取得重磅成果

  2016年1月19日，国际著名医学期刊《Annals of the Rheumatic Diseases》（影响因子10.377，风湿病领域排名第1）发表中南大学湘雅二医院陆前进教授研究团队对系统性红斑狼疮的研究成果。陆教授团队经过3年的艰苦努力，研究开发出一种特异性高、敏感性强系统性红斑狼疮新型诊断标志物，在国际上首次将对该疾病的诊断提升到基因水平。

      伯豪生物华南区销售技术团队在研究过程中的通力合作也得到了陆教授团队的认可，伯豪生物会更加努力协助更多老师取得更大的科研成果。

研究背景：

      系统性红斑狼疮，俗称蝴蝶病，是一种以过量产生多种自身抗体和多器官受累为特征的慢性炎症性自身免疫性疾病。患者体内存在多种自身抗体，抗体与抗原结合形成免疫复合物沉淀在靶组织中，引起一系列炎性介质释放，从而造成器官组织的损伤。

实验设计路线：

差异甲基化位点筛选

实验方法：Infinium Human Methylation 450 BeadChips (Illumina)
样本类型：外周血DNA
样本数量：3例活动期患者 vs 3例正常对照；
                    3例稳定期患者 vs 3例正常对照；

显著差异CpG位点筛选：｜avg. Δβ｜>0.1，且 p value < 0.05；

活动期患者 vs 健康对照
显著差异CpG数量：2099个基因中 3719 CpG位点

稳定期患者 vs 健康对照
显著差异CpG数量：539个基因中 983 CpG位点

选择IFI44L作为候选标志物的原因：
1. IFI44L的所有显著差异CpG位点均位于转录起始位点上游1500bp范围和5’-UTR区域内；
2. IFI44L_cg06872964检测到的CpG位点在活动期患者和稳定期患者外周血DNA中甲基化水平都显著低于健康对照。
3. 课题组之前研究结果也曾发现，在红斑狼疮患者的CD4+细胞和中性粒细胞中IFI44L基因启动子都呈现低甲基化状态。

IFI44L是一种干扰素刺激基因，也就是能被干扰素诱导上调表达的基因。早期研究发现其有一定的抗丙肝病毒活性，最近研究还发现病毒感染会引起人外周血单核细胞IFI44L基因表达上调。

接下来，研究人员开始针对IFI44L启动子区特殊CpG位点，即芯片中cg06872964探针覆盖的2个CpG位点甲基化水平进行了大样本量的焦磷酸测序检测，作为探究该CpG位点是否可作为系统性红斑狼疮诊断标志物的依据。

 

后期验证：共有 4210 个患者和志愿者参与了后期的验证工作。

探索组验证 (验证中国患者对候选标志物的特异性和敏感性)

实验方法：焦磷酸测序 (Pyrosequencing)

样本类型：外周血DNA

样本数量：

377例红斑狼疮患者 vs 358例正常对照
353例类风湿性关节炎患者 vs 358例正常对照

实验结果：
在红斑狼疮患者的外周血单核细胞DNA中，Site 1和Site 2这两个CpG位点的甲基化水平明显低于健康对照和类风湿性关节炎患者。

验证组 1 （验证中国患者对候选标志物的特异性和敏感性）
实验方法：焦磷酸测序 (Pyrosequencing)
样本类型：外周血DNA
样本数量：
529例红斑狼疮患者 vs 569例正常对照
429例类风湿性关节炎患者 vs 569例正常对照
199例原发性干燥综合症 vs 569例正常对照

 

验证组 2 （验证欧洲患者对候选标志物的特异性和敏感性）
实验方法：焦磷酸测序 (Pyrosequencing)
样本类型：外周血DNA
样本数量：615例红斑狼疮患者 vs 781例正常对照

IFI44L启动子甲基化与临床特征的关系
      将906例中国红斑狼疮患者，按照临床特征分成290例肾损害和616例无肾损害两组，结果发现伴有肾损害的患者IFI44L启动子甲基化水平明显低于无肾损害的患者。

另外，研究人员还分别对30例红斑狼疮患者的症状活动和缓解时期的血液样本DNA中2个CpG位点的甲基化水平作了比较，其中86.67% (26/30)和66.67% (20/30) 的患者在缓解期的甲基化水平要高于活动期。

     研究进行到这里，虽然说就已经可以证明IFI44L启动子甲基化水平是一种特异性高、敏感性强的系统性红斑狼诊断标志物，但仍不清楚IFI44L甲基化水平变化的原因。

      因为系统性红斑狼疮患者最显著的一个特征就是外周血单核细胞中受Ⅰ型干扰素调节的基因异常持续过量表达，即所谓“干扰素标记”现象。而且考虑到IFI44L本就是一种干扰素刺激基因，所以研究人员首先怀疑是否可能是由于红斑狼疮患者体内Ⅰ型干扰素过量表达才触发红斑狼疮患者IFI44L启动子的甲基化水平降低。

      为了弄清楚这个疑惑，研究人员采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法，分别从系统性红斑狼疮患者和健康对照的20ml外周血中分离得到外周血单核细胞。研究人员将单核细胞置于在RPMI-1640培养基中培养， 同时用1000 U/L 干扰素-α 刺激单核细胞。焦磷酸测序结果显示在单核细胞培养过程中，即便研究人员使用干扰素-α对单核细胞刺激的时间达到48小时，但作为诊断标志物的IFI44L基因两个CpG位点在患者和健康对照两组的甲基化水平都没有发生明显变化，也就表明并不是由于系统性红斑狼疮患者体内干扰素-α升高才导致患者IFI44L基因的甲基化水平降低。

    本文中的450K甲基化芯片服务以及焦磷酸测序服务均由上海伯豪生物技术服务有限公司提供。

原文出处：
Zhao M, Zhou Y, Zhu B, Wan M, Jiang T, Tan Q, Liu Y, Jiang J, Luo S, Tan Y, Wu H, Renauer P, Del Mar Ayala Gutiérrez M, Castillo Palma MJ, Ortega Castro R, Fernández-Roldán C, Raya E, Faria R, Carvalho C, Alarcón-Riquelme ME, Xiang Z, Chen J, Li F, Ling G, Zhao H, Liao X, Lin Y, Sawalha AH, Lu Q. IFI44L promoter methylation as a blood biomarker for systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 19 January 2016 [PMID: 26787370 ]