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Western Blot样品制备和蛋白表达检测注意事项
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Western Blot是分子生物学和蛋白质组学中最常用的技术之一。但Western Blot是一个多步骤的操作流程，因此任何一个步骤发生错误，都会导致最终的结果发生变异，从而降低了该技术的可靠性和可重复性。有研究表明，Western Blot的一些关键步骤，例如样品制备方法、蛋白表达检测等方法的使用，对于可重现的蛋白质印迹结果至关重要。
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样品制备的原则：
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尽可能采取简单方法，避免蛋白丢失；
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尽可能将所有待分析的蛋白质样品全部溶解；
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细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂防止蛋白降解；
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提取过程中避免蛋白产生聚集、沉淀和变性；
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防止发生人为的蛋白质样品化学修饰（例如加入尿素不要超过37℃，防止氨甲酰化而修饰蛋白）；
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尽可能去除样品中的非蛋白杂质和干扰蛋白；
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样品裂解液新鲜配置，并分装冻存于-80℃。勿反复冻融；
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制备方法应具有标准化、重现性、可靠性和简便性。
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蛋白样品的类型：
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可溶性蛋白：
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培养细胞中可溶性蛋白，包括：细胞质中的可溶性蛋白、细胞周质蛋白、细胞器相关蛋白、分泌到培养基中的可溶性蛋白。
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自然宿主细胞中可溶性蛋白，包括：微生物、植物和动物细胞中的可溶性蛋白。
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不溶性蛋白：
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含包涵体的不溶性蛋白
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膜相关蛋白和难溶性蛋白（非重组蛋白）
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蛋白样品制备的流程：
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组织、细胞或菌体的破碎和裂解
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沉淀溶液中蛋白
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清除杂质
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蛋白浓缩、纯化
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组织或细胞破碎和裂解：
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为了全面分析细胞内的蛋白，需要对组织或者细胞进行有效地破碎和裂解，其方法取决于蛋白样品的来源。同时，因细胞破碎时蛋白酶可能释放出来，从而导致蛋白降解，影响后续实验结果，因此需要加入蛋白酶抑制剂进行保护。
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破碎裂解的方法：
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温和破碎裂解法（针对组分单一或者分析某一特定组分）：
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渗透裂解（血细胞、组织培养细胞）：将细胞悬浮于渗透溶液中，细胞因肿胀而释放细胞内容物。
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冻融裂解（细菌细胞、组织培养细胞）：反复冻融裂解细胞，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起肿胀，使细胞结构破碎。
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裂解液裂解（组织、培养细胞）：含有去污剂的裂解液处理组织或细胞，使细胞膜破碎，细胞内容物释放出来。
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酶裂解（植物、细菌、真菌细胞）：利用酶裂解含有细胞壁的细胞。
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剧烈破碎裂解法（难于破碎细胞：固体组织、坚硬细胞壁）：
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超声裂解（悬浮细胞）：利用超声波产生的切应力来裂解细胞，超声时应在冰上间歇进行。
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弗氏细胞压碎器裂解（含有细胞壁的细胞）：细胞悬液置于高压下强力挤出小孔，压力突然降低以及剪切力的作用导致细胞爆裂破碎。
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机械匀浆裂解（固体组织、细胞悬液）：将组织剪成小块，利用匀浆器在加蛋白酶抑制剂的匀浆液中破碎组织或者细胞。
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研磨法（固定组织、微生物）：样品冻存在液氮中，利用研钵和研杵快速将样品研磨成粉状。
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玻璃珠匀浆裂解（含有细胞壁的细胞）：利用剧烈震荡的玻璃珠打碎细胞的细胞壁，从而释放细胞的内容物。
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裂解液一般组成：
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缓冲液（Tris-HCl）：提供pH环境，使蛋白保持稳定，增加溶解性。
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去污剂（表面活性剂）：破坏蛋白之间的疏水相互作用，以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合。
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蛋白酶抑制剂：抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解。
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磷酸酶抑制剂：抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化。
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还原剂：二硫键断裂和蛋白质变性。
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其它：NaCl，促进细胞膜破裂使蛋白溶解。
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参考文献：
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2017 Nov;14(11):1037-1053.
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An Overview of Technical Considerations for Western Blotting Applications to Physiological Research, Scand J Med Sci Sports . 2017 Jan;27(1):4-25.
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蛋白表达定量检测方法，常规的方法是使用传统的SDS-PAGE免疫印迹方法进行定量。但是传统方法面临以下困境：定量不准确、结果重现性差、冗长的手动操作、实验周期长、需要大量样本。
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由ProteinSimple公司研发的全自动Western Blot技术：Jess & Peggy Sue具有以下特点：
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定量效果好
相对定量or绝对定量
软件自动计算
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重复性好
CV<10%
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时间快
3小时检测，缩短数据周期，加快药物发现的项目
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Western步骤全部自动完成
自动制胶、跑胶、蛋白固定、定量、分析计算全部自动完成，减少人为误差，成为标准化检测方法
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样品量少
只需3μl-5μl（比传统少10-20倍），减少样品准备工作量，提高了检测效率
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Western结果干净
没有条带弥散或者有污点的情况
加快分析速度，推动研究进展
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检测条带图已被Nature, Science, Cell等知名期刊收录发表
近2000多篇文章发表
120多篇文章影响因子大于5
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2021年初，ProteinSimple开始启动2021 Simple Western条带评比大赛，热忱欢迎中国Simple Western用户踊跃报名提交作品。
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报名时间
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2021年1月8号到2021年4月30号
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奖项设置
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一等奖 1名
DJI大疆无人机
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二等奖 1名
Huawei华为手机
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三等奖 1名
Huawei荣耀平板
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极限条带奖 2名
SONY索尼无线蓝牙耳机
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评委会特别奖 5名
JBL音箱
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参与奖
小米背包
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