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Western Blot样品制备和蛋白表达检测注意事项

Western Blot是分子生物学和蛋白质组学中最常用的技术之一。但Western Blot是一个多步骤的操作流程,因此任何一个步骤发生错误,都会导致最终的结果发生变异,从而降低了该技术的可靠性和可重复性。有研究表明,Western Blot的一些关键步骤,例如样品制备方法、蛋白表达检测等方法的使用,对于可重现的蛋白质印迹结果至关重要。

操作步骤
样品制备
样品制备的原则:

尽可能采取简单方法,避免蛋白丢失;

尽可能将所有待分析的蛋白质样品全部溶解;

细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解,低温和蛋白酶抑制剂防止蛋白降解;

提取过程中避免蛋白产生聚集、沉淀和变性;

防止发生人为的蛋白质样品化学修饰(例如加入尿素不要超过37℃,防止氨甲酰化而修饰蛋白);

尽可能去除样品中的非蛋白杂质和干扰蛋白;

样品裂解液新鲜配置,并分装冻存于-80℃。勿反复冻融;

制备方法应具有标准化、重现性、可靠性和简便性。

蛋白样品的类型:

可溶性蛋白:

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培养细胞中可溶性蛋白,包括:细胞质中的可溶性蛋白、细胞周质蛋白、细胞器相关蛋白、分泌到培养基中的可溶性蛋白。

● 

自然宿主细胞中可溶性蛋白,包括:微生物、植物和动物细胞中的可溶性蛋白。

不溶性蛋白:

● 

含包涵体的不溶性蛋白

● 

膜相关蛋白和难溶性蛋白(非重组蛋白)

蛋白样品制备的流程:

组织、细胞或菌体的破碎和裂解

沉淀溶液中蛋白

清除杂质

蛋白浓缩、纯化

组织或细胞破碎和裂解:

为了全面分析细胞内的蛋白,需要对组织或者细胞进行有效地破碎和裂解,其方法取决于蛋白样品的来源。同时,因细胞破碎时蛋白酶可能释放出来,从而导致蛋白降解,影响后续实验结果,因此需要加入蛋白酶抑制剂进行保护。

破碎裂解的方法:

温和破碎裂解法(针对组分单一或者分析某一特定组分):

● 

渗透裂解(血细胞、组织培养细胞):将细胞悬浮于渗透溶液中,细胞因肿胀而释放细胞内容物。

● 

冻融裂解(细菌细胞、组织培养细胞):反复冻融裂解细胞,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起肿胀,使细胞结构破碎。

● 

裂解液裂解(组织、培养细胞):含有去污剂的裂解液处理组织或细胞,使细胞膜破碎,细胞内容物释放出来。

● 

酶裂解(植物、细菌、真菌细胞):利用酶裂解含有细胞壁的细胞。

剧烈破碎裂解法(难于破碎细胞:固体组织、坚硬细胞壁):

● 

超声裂解(悬浮细胞):利用超声波产生的切应力来裂解细胞,超声时应在冰上间歇进行。

● 

弗氏细胞压碎器裂解(含有细胞壁的细胞):细胞悬液置于高压下强力挤出小孔,压力突然降低以及剪切力的作用导致细胞爆裂破碎。

● 

机械匀浆裂解(固体组织、细胞悬液):将组织剪成小块,利用匀浆器在加蛋白酶抑制剂的匀浆液中破碎组织或者细胞。

● 

研磨法(固定组织、微生物):样品冻存在液氮中,利用研钵和研杵快速将样品研磨成粉状。

● 

玻璃珠匀浆裂解(含有细胞壁的细胞):利用剧烈震荡的玻璃珠打碎细胞的细胞壁,从而释放细胞的内容物。

裂解液一般组成:

缓冲液(Tris-HCl):提供pH环境,使蛋白保持稳定,增加溶解性。

去污剂(表面活性剂):破坏蛋白之间的疏水相互作用,以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合。

蛋白酶抑制剂:抑制蛋白酶的活性,防止蛋白被水解。

磷酸酶抑制剂:抑制磷酸酶的活化,防止蛋白样本脱磷酸化。

还原剂:二硫键断裂和蛋白质变性。

其它:NaCl,促进细胞膜破裂使蛋白溶解。

参考文献:

2017 Nov;14(11):1037-1053.

An Overview of Technical Considerations for Western Blotting Applications to Physiological Research, Scand J Med Sci Sports . 2017 Jan;27(1):4-25.

样品蛋白表达检测方法

蛋白表达定量检测方法,常规的方法是使用传统的SDS-PAGE免疫印迹方法进行定量。但是传统方法面临以下困境:定量不准确、结果重现性差、冗长的手动操作、实验周期长、需要大量样本。

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