HEG1 通过调节内皮细胞中KLF2/4 表达来预防动脉粥样硬化

HEG1 Protects Against Atherosclerosis by Regulating Stable Flow-Induced KLF2/4 Expression in Endothelial Cells

Keywords: KLF2/4; atherosclerosis; endothelial cells; heart-of-glass 1; mechanobiology.

动脉粥样硬化优先发生在血流模式紊乱（d-flow）的血管分支和弯曲区域，内皮细胞（ECs）暴露于致动脉粥样硬化的振荡、低幅度剪切应力（OSS）。相比之下，暴露于稳定血流模式（s-flow）下的直向、非分支区域的血管提供单向、层流、高幅度的剪切应力（ULS），促进内皮稳态，不会发生动脉粥样硬化。ECs 响应这些不同的血流模式而发生的促动脉粥样硬化和抗动脉粥样硬化变化在很大程度上是由血流敏感基因的转录变化介导的。在 s-flow 中调节的基因通常在预防 EC 功能障碍和动脉粥样硬化中发挥作用，而由 d-flow 调节的基因通常促进 EC 功能障碍和动脉粥样硬化。

具有EGF样结构域的心脏发育蛋白1（heart-of-glass homolog 1，HEG1）是一种粘蛋白类膜蛋白，在内皮细胞中富集，在胚胎发育和血管生成中起关键作用。研究已将其确定为小鼠动脉 ECs 中的血流敏感基因。尽管HEG1基因敲除在心脏发育和血管形态发生中的作用已被证实，但其在成年动脉EC功能中响应血流和动脉粥样硬化的作用尚不清楚。

鉴于此，美国佐治亚理工学院和埃默里大学Wallace H. Coulter生物医学工程系的研究团队表明，HEG1 由 s-flow 诱导，被 d-flow 降低，并以 KLF2/4（Krüppel 样因子 2/4）依赖性方式介导 s-flow诱导的内皮功能。研究成果发表于 Circulation 期刊题为“HEG1 Protects Against Atherosclerosis by Regulating Stable Flow-Induced KLF2/4 Expression in Endothelial Cells”。
小鼠PCL手术后结扎左侧颈总动脉（LCA）暴露于 d-flow，同时使用继续暴露于s-flow 的右侧颈总动脉（RCA）作为内部对照。scRNA-seq 分析显示，Heg1 主要在 ECs 和成纤维细胞中表达，且与暴露于 d-flow 的 EC 相比，s-flow 条件下发现的 EC 簇表达 Heg1 水平显著升高。这表明，EC 中 Heg1 表达具有流量敏感性，s-flow 上调，d-flow 下调Heg1 表达。

为了确认这些体内结果并表征血流对 HEG1 的调节，将 HAECs 暴露于 ULS（15 dyn/cm2，模拟 s-flow）或 OSS （+5/–4 dyn/cm2，1 Hz，模拟 d-flow），静态条件下的 HAECs用作对照。与 OSS 和静态条件相比，暴露于 ULS 24 小时显著增加了 HEG1 mRNA 和蛋白质表达（图1 A、B）。令人惊讶的是，在 ULS 下HAECs 的条件培养基中也检测到 HEG1 蛋白，但在 OSS 或静态培养基中未检测到（图1 C）。为了进一步描述这种血流反应，进行了 2 种不同的时间过程研究。结果表明，HEG1 蛋白在最初前 3 小时内减少，因为它在响应ULS时连续释放到介质中而没有新的转录，6 小时后，HEG1 mRNA 和蛋白表达恢复，表明新的转录和翻译呈血流依赖性（图1 D-I）。

免疫荧光显微镜检测表明，与静态或 OSS 条件相比，暴露于 ULS 24 小时增加了 HAECs 中 HEG1 蛋白的表达（图1 J）。令人惊讶的是，与在静态细胞和 OSS 细胞中观察到的弥漫性染色模式不同，HEG1 染色模式在 ULS 的刺激下显示出对 ECs 下游的显著定位。进一步测试发现，在 ULS 条件下，早在 2 分钟，HEG1 蛋白就向下游移动至细胞间连接区域（图1 K），表明s-flow 可快速诱导 HEG1 蛋白易位至 ECs 的下游。这些体外和体内结果表明，血流调节 HEG1 基因、蛋白质表达、极化定位以及条件培养基中的释放。

在确定 HEG1 是一种血流敏感基因和因 s-flow 而增加的蛋白质后，在流动条件下通过 siRNA 敲低在 HAECs 中测试其功能意义。正如预期的那样，ULS 抑制了 HAECs 的单核细胞粘附、通透性和迁移反应，而使用 siRNA 敲低 HEG1 可以阻止这些作用。此外，敲低 HEG1 还阻止了 ULS 介导的对 HAECs 中VCAM1 抑制以及 eNOS 诱导的影响。这些结果表明，HEG1 在介导 s-flow诱导的内皮功能调节中起关键作用。

图1 体外单向层流剪切应力（ULS）诱导人主动脉EC（HAEC） HEG1 mRNA 和蛋白质表达，刺激蛋白质分泌到培养基中并在向下游易位。

接下来研究了 HEG1 介导 EC 中 s-flow 效应的机制，假设 HEG1 调节 2 个关键 s-flow 诱导的转录因子 KLF2/4 的表达，这反过来介导 s-flow 的转录和功能效应。为了检验这一假设，在用 siHEG1 和 ULS 处理 3 小时的 HAECs 中检测 KLF2/4 mRNA 和蛋白表达，发现HEG1 表达降低。ULS 显著诱导了 KLF2/4 mRNA 和蛋白质表达，而敲低 HEG1 会显著减弱 KLF2/4 mRNA 和蛋白表达。这清楚地证明了 HEG1 在 ULS 调节 KLF2/4 表达中的关键作用。

ULS 通过激活 ECs 中的 MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2 通路来调节 KLF2/4 表达，但上游血流激活机制仍然未知。因此，使用特异性药理学抑制剂和 HEG1 siRNA 敲低测试了HEG1通过ULS调节KLF2/4表达是否也由 MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2 通路介导。正如预期，ULS 增加了 ERK5 磷酸化，而敲低 HEG1降低了磷酸化，这提供了 HEG1 调控 ERK5 的关键证据，ERK5 是 ULS 介导的 KLF2/4 表达通路中的关键信号蛋白。

然后，用 MEKK3（Ponatinib）、MEK5（BIX02189）和 ERK5（XMD8-92）的特异性抑制剂处理 HAECs，检测 HEG1 与 MEKK3-MEK5-ERK5-KLF2/4 通路响应 ULS 的层次关系。Ponatinib、BIX02189、XMD8-92处理均抑制 ULS 诱导的 ERK5 磷酸化和 KLF2/4 表达，但对 HEG1 表达没有影响。这些结果表明，HEG1 是 ULS 诱导的 ECs 中 MEKK3-MEK5-ERK5-KLF2/4 通路的上游调节因子。此外，还发现HAECs 中过表达 KLF4 挽救了 ULS 对 eNOS 诱导、VCAM1 抑制和迁移抑制的影响。这些结果进一步验证了 HEG1 通过调控 MEKK3-MEK5-ERK5-KLF2/4 通路介导保护性 ULS 对 EC 功能的影响。

KRIT1，也称为脑海绵状血管畸形1（CCM1），是 MEKK3 激活的抑制剂。尽管已知 KRIT1 和 CCM 复合物与 MEKK3 的解离会激活 MEKK3-KLF2/4 通路，但尚不清楚 KRIT1 是否调节血流诱导的 MEKK3-KLF2/4 通路。实验结果表明，敲低KRIT1 增强了 ULS 下 ERK5 磷酸化和 KLF2/4 表达，证明了 KRIT1 在 MEKK3-MEK5-ERK5-KLF2/4 通路血流激活中的抑制作用（图2 A）。有趣的是，尽管 ULS 增加了 KRIT1 mRNA 表达，但 ULS 降低了细胞裂解物中的 KRIT1 蛋白水平（图2 B）。

因为已知 KRIT1 结合 HEG1，且数据显示 HEG1 蛋白响应 ULS 释放到培养基中，因此测试了 KRIT1 蛋白是否也与 HEG1 一起释放到培养基中。令人惊讶的是，KRIT1 响应 ULS 而释放到培养基中，而不是在静态或 OSS 条件（图2 C）。在 ULS 条件下，敲低HEG1 阻止了 KRIT1 的释放（图2 D），并且细胞裂解物中的 KRIT1 蛋白恢复到对照水平（图2 E）。这些结果表明，KRIT1 以 HEG1 依赖性方式释放到培养基中。HEG1 与 KRIT1 的免疫共沉淀进一步支持了这一结果，无论剪切条件如何，它都保持不变（图2 F）。

这些结果提出了一个有趣的假设，即 ULS 促进 HEG1 与 MEKK3 抑制剂 KRIT1 一起从 ECs 释放到培养基中，从而激活 MEKK3-MEK5-ERK5-KLF2/4 通路。

图2 ULS 降低细胞内以 HEG1 依赖性方式释放的 KRIT1 蛋白水平，刺激 ERK5-KLF2/4 通路。

此外，使用高脂饮食小鼠急性 PCL 模型测试了他莫昔芬诱导的 EC 特异性 HEG1 敲除对动脉粥样硬化的影响，发现EC 中的 HEG1 敲除显著加速晚期斑块的发展，其特征是脂质病变面积、坏死核心面积和 CD68 阳性巨噬细胞浸润增加。然后，使用常规饮食诱导的动脉粥样硬化模型，在不进行PCL手术的情况下测试了他莫昔芬诱导的 EC 特异性 HEG1 敲除对动脉粥样硬化的影响，发现HEG1 敲除小鼠以性别和主动脉位置依赖的方式比对照小鼠出现更多的动脉粥样硬化斑块。这些结果表明，HEG1 敲除小鼠的PCL模型中的颈动脉和慢性模型中的主动脉弓在两性中都表现出强烈的动脉粥样硬化恶化。然而，HEG1敲除小鼠在雄性降主动脉和主动脉窦中表现出适度的致动脉粥样硬化作用，而在雌性中则没有，证明了内皮 HEG1 缺失的主动脉位置和性别依赖性促动脉粥样硬化作用。

最后，实验测试了 HEG1 表达水平是否与人冠状动脉粥样硬化斑块的严重程度相关。结果表明，在未患病的人冠状动脉的 ECs 中发现丰富的 HEG1 表达。然而，与未患病的ECs相比，HEG1 蛋白在晚期动脉粥样硬化病变（范围 III-IV 和 V-VI）上的 ECs 中表达降低（图3 A、B）。这些结果表明，内皮 HEG1 表达的降低与人冠状动脉的晚期动脉粥样硬化发展相关，突出了 HEG1 表达的临床相关性。

图3 HEG1表达在晚期斑块的冠状动脉中显著降低。

（C）响应 ECs 中的 d-flow（OSS）和 s-flow（ULS）的HEG1 调控机制和作用。在 d-flow 条件下，HEG1 蛋白以低水平表达，随机位于 EC 膜中，并与 KRIT1 结合，使 MEKK3 失活，导致 KLF2/4 低表达和致动脉粥样硬化表型。在 s-flow条件下，HEG1 蛋白易位到下游，并与 KRIT1 一起分泌到培养基中，导致 MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2 通路激活，诱导 KLF2/4 表达。KLF2/4 是一种众所周知的 s-flow 诱导的转录因子，可诱导数百个靶基因的表达，从而维持 EC 稳态和动脉粥样硬化保护。

总之，该研究显示，HEG1 是一种新型的动脉粥样硬化保护性、血流敏感蛋白，在 ECs 中以 KRIT1 依赖性方式调节 MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2-KLF2/4 通路。血流依赖性 HEG1-KRIT-MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2-KLF2/4 通路为抗动脉粥样硬化疗法的开发提供了新的靶点。

参考文献：Tamargo IA, Baek KI, Xu C, Kang DW, Kim Y, Andueza A, Williams D, Demos C, Villa-Roel N, Kumar S, Park C, Choi R, Johnson J, Chang S, Kim P, Tan S, Jeong K, Tsuji S, Jo H. HEG1 Protects Against Atherosclerosis by Regulating Stable Flow-Induced KLF2/4 Expression in Endothelial Cells. Circulation. 2024 Apr 9;149(15):1183-1201. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.123.064735. Epub 2023 Dec 15. PMID: 38099436; PMCID: PMC11001532.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38099436/

IF：35.6

ISSN：0009-7322

E-ISSN：1524-4539

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