EVIDENT共聚焦/超分辨助力Nature发文揭示应激颗粒亚型鉴定范式
本文作者：尚泽华
四川大学生物治疗全国重点实验室贾大课题组
应激颗粒（SGs）是真核细胞在应对缺氧、热休克、病毒感染和氧化应激等各种应激时形成的无膜 RNA 颗粒1。SGs 的形成会导致细胞新陈代谢的重新规划、翻译的抑制以及正常细胞信号的改变，从而帮助细胞存活。SG 是通过一种称为液-液相分离（LLPS）的物理过程形成的，其中包含许多蛋白质，包括小核糖体亚基、翻译起始因子、翻译受阻的 mRNA 和 RNA 结合蛋白2。最近发现了一个由 36 个 SG 蛋白组成的核心 SG 网络，其中 G3BP1/2 是中心节点3。这些蛋白对调节 SG 的组装和功能至关重要。在许多病理情况下，如病毒感染4-8、神经退行性疾病9-11和癌症12、13等，SG的组装和分解失调都会发生，这突出了SG在人类疾病中的重要性。最近的研究发现，不同类型的应激会诱导不同的 SG 亚型，这些亚型在组成、组装和解体的动态以及细胞功能方面各不相同14。例如，亚砷酸钠或热休克处理会诱导形成典型的 SG，这种 SG 更具有活力，能起到促进生存的作用15。与此相反，亚硒酸钠等化疗药物或紫外线照射会导致非典型 SG 的形成，这种 SG 的动态性较弱，对细胞有促进凋亡的作用15、16。尽管应激特异性 SG 亚型的概念正在形成7、15、17-19，但它们不同的蛋白质和 RNA 组成及功能在很大程度上仍未得到探索。
2024年5月15日，四川大学生物治疗全国重点实验室贾大课题组与合作者在Nature communications杂志( IF=16.6 (2023) / JCR分区: Q1 )在线发表了题为“TRIM25 predominately associates with anti-viral stress granules“ 的研究论文。该工作利用 G3BP1 邻近蛋白生物素化标记实验发现 TRIM25 是抗病毒 SG 的有效标记物。课题组成员发现 TRIM25 会独立发生 LLPS 现象，而 dsRNA 的存在会显著增强这种反应。Poly(I:C)处理和RNA病毒感染都会引发TRIM25和G3BP1的共相分离，从而显著提高TRIM25对底物的泛素化活性，其中许多底物都定位于SGs中。TRIM25和G3BP1的共相分离对激活RIG-I信号通路和限制RNA病毒感染至关重要。该研究不仅为抗病毒信号通路的调控提供了新的见解，而且为研究应激特异性 SG 亚型的组成、动态和功能建立了一个研究范式。
该研究首先采用了一种邻近生物素化标记（BioID）方法（图1）来鉴定poly(I:C)刺激下的 G3BP1 相互作用网络。在 937 个差异蛋白中，有 181 个属于以前鉴定的 SG 蛋白成分，包括许多 SG 核心蛋白，如 HDAC6 和 DDX3X。有趣的是，TRIM25在所有蛋白中增加最为显著，它是一个泛素化依赖性抗病毒先天免疫反应的驱动蛋白，经 poly(I:C) 处理后富集了 130 倍（图1）。这意味着，poly(I:C) 处理会刺激 TRIM25 被招募到 SG（即抗病毒 SG）中。
(A) G3BP1 BioID 方法与基于 TMT 的定量蛋白质组学相结合的示意图。(B) 如(A)中所确定的，由 poly(I:C) 处理诱导的 SGs 核心蛋白列表。
(A) 具有代表性的荧光显微镜图像显示了在各种应激条件下 TRIM25 与 HeLa 细胞中内源性 G3BP1 的共定位。(B) TRIM25 和 G3BP1 病灶之间的最短距离。在 HeLa 细胞中，各种应激类型如（A）所示。在所有应激类型中，Sev 感染和 poly(I:C) 处理导致的距离最短。
(A) 转染 poly(I:C) 后 G3BP1（绿色）和 TRIM25 WT 或 ∆PTFG （红色）点状颗粒形成的延时显微照片，以及转染后 6 小时或 10 小时斑点的放大图像。比例尺：10 µm。插图：白色框内区域的放大图。(B) TRIM25 的 PTFG 基序是与 HeLa 细胞中的 G3BP1 共定位所必需的。细胞转染了 GFP-TRIM25 ∆PTFG 而不是 TRIM25 WT。比例尺：10 μm。
(A-D) 用 TRIM25 WT、TRIM25 PTFGAAAA或∆PTFG转染HEK293T细胞，然后用poly(I:C) 处理 12 小时。用qPCR测定IFNα (A)、IFNβ (B)、IFNγ (C)和ISG56 (D)的 mRNA 水平。
本文中多色荧光标记的细胞图像都是采用Evident激光扫描共聚焦FV3000拍摄。FV3000的全真光谱技术可以自由调整标记荧光信号的收集波段，并有效防止不同标记之间的荧光串扰，帮助用户获取更加真实可靠的数据。另外，本文还利用FV3000观察了活细胞中的G3BP1液滴以及通过FRAP实验验证了其相分离特性。FV3000灵活高效的龙卷风光刺激模式以及追踪运动中的液滴并分析其漂白区域荧光强度变化的功能，是帮助用户进行相分离研究的利器。（Evident新一代激光扫描共聚焦系统FV4000现已发布。）
文章中的活细胞实验采用了Evident转盘共聚焦超分辨系统SpinSR，其高速、高分辨率和低光毒性的特点，适合对快速动态变化的活细胞进行长时程观察。
四川大学生物治疗全国重点实验室贾大研究员与四川大学基础与法医学院Peng Bai为本文的共同通讯作者。硕士生尚泽华，博士生张思韬、王瑾瑞为本文共同第一作者，苏州大学博士生周莉莉、四川大学华西生物治疗国重创新班本科生张欣悦也为本研究做出重要贡献。本研究还得到了周芳芳、杨培国、Daniel D. Billadeau、张令强等教授的大力支持，并得到了李丕龙教授的指导和帮助。
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