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光片显微镜技术原理及应用

浏览次数:2727 发布日期:2023-8-24  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
自17世纪荷兰科学家列文虎克研制出光学显微镜以来,人类对于微观世界的探索如火如荼。光学显微镜由于其对样品损伤低、成像机制多等优点,已经成为了微观医学研究上不可或缺的工具。随着生物医学领域研究不断拓展,对于光学显微镜的成像速度、空间分辨率、成像质量等方面也提出了更高的要求。

目前新型显微镜主要有双光子、共聚焦、光片等显微镜。而光片显微镜在近几年飞速发展,以大视野、成像速度快、低光毒性、低光漂白等优势而被广泛关注。

光片显微镜原理
    光片荧光显微镜,是一种新型的三维显微成像技术,采用正交光路设计,用一层薄光片从侧面激发样品,并且在垂直于光片的方向上利用显微物镜和数字相机拍摄样品的二维荧光图像,通过轴向扫描光片或移动样品逐面成像,获取不同深度处的层析图像最终实现样品的三维重构。

图1. 光片显微镜结构示意图
 
光片显微镜的优势
1. 大视野、成像速度快
光片显微镜采用的是高QE的CCD或者sCMOS相机,可以做到面成像,大大提高了成像的速度和图像的信噪比。工作时,光片一次曝光穿过样品,得到的光学切片可以得到在此平面上样品的全部信息,大大减少了成像需要的时间。
2. 低光毒性、低光漂白
光毒性是指在较长时间的强光照射下,生物样本细胞内的荧光分子会产生分解现象。光漂白是指荧光成像的质量很大程度上依赖于荧光信号强度,提高激发光强度固然可以提高信号强度,但当激发光的强度超过一定限度时,光吸收就趋于饱和,并不可逆地破坏激发态分子。
光片显微镜与传统的荧光照明技术相比,光照是从样品的侧面发出,只会照亮平面上的样品组织,这样光毒性可以被降低很多倍,可以在更接近生理状态的条件下,对活体生物样品进行长时间的三维成像。
3. 对比度高
提高了图像和背景的反差和轴向分辨率,光片照明技术使焦平面上下的样品不会被激发。
 

图2. 传统显微镜与光片显微镜的差异
 
样品组织透明化
由于细胞中的色素及其它成分对光的散射和吸收,使光难以达到生物组织的深处。组织透明化技术(Tissue Clearing)是破解这一难题最重要的技术手段之一。生物组织是由不同光学特性的非均质成分组成,这会使入射光进入之后发生散射,限制光学成像的深度。对此,目前科研人员开发了三种组织透明化的方法。
①油性生物组织透明化方法
油性组织透明化主要是利用带有高折射率介质的光学透明剂取代组织中原本的水分和脂质来平衡折射率,这种方法透明化效果较好,但是荧光蛋白容易被破坏,信号不易保存。
②水凝胶透明化方法
水凝胶方法主要是将样品包埋在水凝胶中,使样品中的蛋白质和核酸分子与水凝胶形成共价连接,从而起到保护和固定作用。
③水性生物组织透明化方法
由于组织中的荧光蛋白分子带有亲水基团,所以与油性透明化方法相比,水性更利于荧光信号保存,但是也存在透明时间较长、透明度差等缺点。目前分为单纯浸泡透明与高水化脱脂透明两种方法。单纯浸泡是利用渗透压的原理,将组织样品泡在高折射率溶液中,使得组织内外被溶液被替换,从而平衡折射率。高水化法是利用氨基醇类与去垢剂类物质将样品组织的脂质去除,然后利用水化作用降低样品折射率实现组织透明化。

光片显微镜应用范围
借助于光片显微镜,脑科学可应用于全脑神经、血管等结构三维高精度成像,用于神经退行性疾病、脑栓塞等研究;神经科学可以研究神经元神经传导途径及修复再生能力;呼吸科学可以用于呼吸系统致病及肺损伤机制、免疫应答及药物筛选研究;肿瘤学可以用于肿瘤微环境,转移,侵袭及药物筛选;免疫学科也可以更完整的研究淋巴系统的发育过程;骨科学可以用于骨骼修复与骨再生相关研究;发育科学可以用于研究模型动物各个阶段的组织与器官的发育和功能。 
来源:广东骏楠光子科技有限公司
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