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《Acta Biomater》:3D培养神经干细胞球状体薄片移植改善脑损伤

浏览次数:3424 发布日期:2023-7-4  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
对于轻度创伤性脑损伤(TBI)后的神经元功能障碍,目前尚无有效的临床适用的治疗方法。为此,韩国翰林大学Jin Pyeong Jeon教授及其团队评估了一种新的使用水凝胶的小鼠神经干细胞(mNSC)球状体传递方法的治疗效果,以改善轻度创伤性脑损伤后的皮质损伤和认知障碍。采用水凝胶培养系统从心室下区和颗粒下区分离mNSCs。绿色荧光蛋白(GFP)转导的mNSCs被生成球状体,并包裹成薄片进行移植。将雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组:假手术、TBI、TBI加mNSC球状体移植、TBI加mNSC球状体薄片移植。在创伤后移植后7、14和28天评估组织病理学和免疫组化特征和认知功能。从成年小鼠中成功建立了水凝胶培养系统和mNSC分离。NSCs的必需转录因子在mNSCs中高表达,如SOX2、PAX6、Olig2、巢蛋白和双皮质素(DCX)。移植的水凝胶基mNSC球状体薄片具有良好的移植和存活能力,分化为TUJ1阳性神经元,促进血管生成,减少神经元变性。此外,接受mNSC球状体薄片移植治疗的TBI小鼠对新物体的偏好显著增加,表明与mNSC球状体或未接受治疗的组相比,认知功能得到改善。因此,水凝胶mNSC球状体薄片移植显示脑外伤后传递细胞在恶劣微环境中的移植、迁移和稳定性,通过重建受损皮质,改善认知功能。

相关研究内容以“Therapeutic effect of a hydrogel-based neural stem cell delivery sheet for mild traumatic brain injury”为题于2023年6月23日发表在《Acta Biomater》期刊。
 
图1 小鼠脑源性NSCs的分离和长期培养

培养1周后确认mNSCs的出现,然后从脑组织碎片持续增殖和迁移到水凝胶中(图1A)。采用选择水凝胶裂解法分离出水凝胶中的高密度mNSC,并采用matrigel包覆的2D培养法成功传代(图1B)。通过集落形成单元(CFU)实验,三种培养物均证实了mNSCs的自我更新能力(图1C、D)
 
图2 2D培养中分离的mNSC的免疫表型特征

分离的mNSCs通过SVZ和SGZ中以特异性的NSCs标记物表达(图2A)。流式细胞术分析显示,大量的mNSCs表达SOX2、巢蛋白、PAX6、DCX和Olig2。当使用大脑中存在的几种成熟细胞标记物来确认分离的mNSCs的纯度时,神经元、星形胶质细胞、平滑肌细胞和小胶质细胞/巨噬细胞的标记物只显示出很少的表达(图2B-D)。
 
图3 mNSC球状体的体外多重分化潜能和迁移能力

通过3D构建来考虑表型、粘附和代谢的影响。免疫荧光染色结果显示,2D单层条件下的mNSCs的微管蛋白、beta3III类(TUJ1)、微管相关蛋白2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Olig2均呈阳性(图3A)。在3D球形条件下,其表达水平升高。其中NeuN和S100B表达明显,提示终末分化的神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞或少突胶质细胞(图3B)。RT-PCR结果显示,分化的mNSCs在3D球状体条件下的mRNA水平升高(图3C)。mNSC SP具有连续迁移/入侵水凝胶的能力,利用转换后的8位图像的面积测量来估计迁移/入侵距离(图3D、E)。
 
图4 基于水凝胶的增强绿色荧光蛋白的mNSCs 3D组织工程

在本研究中,使用慢病毒增强的绿色荧光蛋白(EGFP)跟踪系统评估移植的mNSC球状体在损伤病变中的植入、分化和重建(图4A)。慢病毒感染3天后,大多数mNSCs显示GFP表达,没有形态学变化,并形成球状体(图4B)。根据每个细胞数的直径,确定球状体的最佳细胞数在1000~2000个细胞之间(图4C、D)。为了在大规模上生成均匀的球状体,推荐直径约为100 μm,根据细胞数量优化了培养条件(图4E)。作者观察了mNSC在水凝胶中的迁移和球状体之间的神经网络结构(图4F)。
 
图5 轻度TBI模型中mNSC球状片移植后mNSC的治疗效果

与TBI和原位凝胶小鼠相比,GFP阳性的mNSCs在损伤的皮质中存活了7、14和28 天,这表明通过mNSC球状体薄片移植可以防止大规模的细胞丢失(图5A、B)。在沿胼胝体的海马额叶区也观察到GFP阳性的mNSCs,表明其具有体内迁移能力(图5C)。宿主组织的皮质神经元和星形胶质细胞被整合并相互作用,引导移植的mNSCs的轴突生长(图5D)。mNSC SP片可以存活并支持神经元细胞在移植后28天内存活(图5E)。
 
图6 移植的mNSC球状薄片可减少轻度创伤性脑损伤模型中的认知障碍

在测量学习和记忆的NOR测试中,与mNSC SP组的mTBI小鼠在7 DPT和28 DPT时新物体探索的频率显著增加(图6A、B)。与使用mNSC SP组的mTBI或mTBI组相比,使用mNSC球状体薄片移植的mTBI小鼠在移植后7 、14和28 天,新物体探索的频率显著增加(图6A、B)。Y-迷宫试验还显示,与mNSC SPs移植组相比,使用mNSC球状体薄片移植组的mTBI小鼠在移植后7 天,新臂进入的交替数量显著增加(图6C、D)。这些数据表明,mNSC球状体薄片移植可能比mNSC SP移植更有助于改善认知损伤。

综上所述,本研究建立了一个在胶原/纤维蛋白水凝胶中来自成人mNSCs的NSCs的3D培养系统。胶原蛋白和纤维蛋白可以用于创伤后的中枢神经系统(CNS)修复,因为它们具有高度的生物相容性、可生物降解和无毒。本研究表明尽管存在恶劣的微环境,水凝胶mNSC球状体薄片的移植显示了损伤皮质病变中传递细胞的移植、迁移和稳定性。水凝胶mNSC球状片可以通过重建创伤性脑损伤后受损皮质,为受损认知功能的恢复提供有前途的治疗。

文章来源:
https://doi.org/10.1016/j.actbio.2023.06.027
来源:苏州永沁泉智能设备有限公司
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