《Acta Biomater》：3D培养神经干细胞球状体薄片移植改善脑损伤
对于轻度创伤性脑损伤（TBI）后的神经元功能障碍，目前尚无有效的临床适用的治疗方法。为此，韩国翰林大学Jin Pyeong Jeon教授及其团队评估了一种新的使用水凝胶的小鼠神经干细胞（mNSC）球状体传递方法的治疗效果，以改善轻度创伤性脑损伤后的皮质损伤和认知障碍。采用水凝胶培养系统从心室下区和颗粒下区分离mNSCs。绿色荧光蛋白（GFP）转导的mNSCs被生成球状体，并包裹成薄片进行移植。将雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组：假手术、TBI、TBI加mNSC球状体移植、TBI加mNSC球状体薄片移植。在创伤后移植后7、14和28天评估组织病理学和免疫组化特征和认知功能。从成年小鼠中成功建立了水凝胶培养系统和mNSC分离。NSCs的必需转录因子在mNSCs中高表达，如SOX2、PAX6、Olig2、巢蛋白和双皮质素（DCX）。移植的水凝胶基mNSC球状体薄片具有良好的移植和存活能力，分化为TUJ1阳性神经元，促进血管生成，减少神经元变性。此外，接受mNSC球状体薄片移植治疗的TBI小鼠对新物体的偏好显著增加，表明与mNSC球状体或未接受治疗的组相比，认知功能得到改善。因此，水凝胶mNSC球状体薄片移植显示脑外伤后传递细胞在恶劣微环境中的移植、迁移和稳定性，通过重建受损皮质，改善认知功能。
相关研究内容以“Therapeutic effect of a hydrogel-based neural stem cell delivery sheet for mild traumatic brain injury”为题于2023年6月23日发表在《Acta Biomater》期刊。
培养1周后确认mNSCs的出现，然后从脑组织碎片持续增殖和迁移到水凝胶中（图1A）。采用选择水凝胶裂解法分离出水凝胶中的高密度mNSC，并采用matrigel包覆的2D培养法成功传代（图1B）。通过集落形成单元（CFU）实验，三种培养物均证实了mNSCs的自我更新能力（图1C、D）
分离的mNSCs通过SVZ和SGZ中以特异性的NSCs标记物表达（图2A)。流式细胞术分析显示，大量的mNSCs表达SOX2、巢蛋白、PAX6、DCX和Olig2。当使用大脑中存在的几种成熟细胞标记物来确认分离的mNSCs的纯度时，神经元、星形胶质细胞、平滑肌细胞和小胶质细胞/巨噬细胞的标记物只显示出很少的表达（图2B-D）。
通过3D构建来考虑表型、粘附和代谢的影响。免疫荧光染色结果显示，2D单层条件下的mNSCs的微管蛋白、beta3III类（TUJ1）、微管相关蛋白2（MAP2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和Olig2均呈阳性（图3A）。在3D球形条件下，其表达水平升高。其中NeuN和S100B表达明显，提示终末分化的神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞或少突胶质细胞（图3B）。RT-PCR结果显示，分化的mNSCs在3D球状体条件下的mRNA水平升高（图3C）。mNSC SP具有连续迁移/入侵水凝胶的能力，利用转换后的8位图像的面积测量来估计迁移/入侵距离（图3D、E）。
在本研究中，使用慢病毒增强的绿色荧光蛋白（EGFP）跟踪系统评估移植的mNSC球状体在损伤病变中的植入、分化和重建（图4A）。慢病毒感染3天后，大多数mNSCs显示GFP表达，没有形态学变化，并形成球状体（图4B）。根据每个细胞数的直径，确定球状体的最佳细胞数在1000~2000个细胞之间（图4C、D）。为了在大规模上生成均匀的球状体，推荐直径约为100 μm，根据细胞数量优化了培养条件（图4E）。作者观察了mNSC在水凝胶中的迁移和球状体之间的神经网络结构（图4F）。
与TBI和原位凝胶小鼠相比，GFP阳性的mNSCs在损伤的皮质中存活了7、14和28 天，这表明通过mNSC球状体薄片移植可以防止大规模的细胞丢失（图5A、B）。在沿胼胝体的海马额叶区也观察到GFP阳性的mNSCs，表明其具有体内迁移能力（图5C）。宿主组织的皮质神经元和星形胶质细胞被整合并相互作用，引导移植的mNSCs的轴突生长（图5D）。mNSC SP片可以存活并支持神经元细胞在移植后28天内存活（图5E）。
在测量学习和记忆的NOR测试中，与mNSC SP组的mTBI小鼠在7 DPT和28 DPT时新物体探索的频率显著增加（图6A、B）。与使用mNSC SP组的mTBI或mTBI组相比，使用mNSC球状体薄片移植的mTBI小鼠在移植后7 、14和28 天，新物体探索的频率显著增加（图6A、B）。Y-迷宫试验还显示，与mNSC SPs移植组相比，使用mNSC球状体薄片移植组的mTBI小鼠在移植后7 天，新臂进入的交替数量显著增加（图6C、D）。这些数据表明，mNSC球状体薄片移植可能比mNSC SP移植更有助于改善认知损伤。
综上所述，本研究建立了一个在胶原/纤维蛋白水凝胶中来自成人mNSCs的NSCs的3D培养系统。胶原蛋白和纤维蛋白可以用于创伤后的中枢神经系统（CNS）修复，因为它们具有高度的生物相容性、可生物降解和无毒。本研究表明尽管存在恶劣的微环境，水凝胶mNSC球状体薄片的移植显示了损伤皮质病变中传递细胞的移植、迁移和稳定性。水凝胶mNSC球状片可以通过重建创伤性脑损伤后受损皮质，为受损认知功能的恢复提供有前途的治疗。
文章来源：
https://doi.org/10.1016/j.actbio.2023.06.027
相关研究内容以“Therapeutic effect of a hydrogel-based neural stem cell delivery sheet for mild traumatic brain injury”为题于2023年6月23日发表在《Acta Biomater》期刊。
图1 小鼠脑源性NSCs的分离和长期培养
培养1周后确认mNSCs的出现，然后从脑组织碎片持续增殖和迁移到水凝胶中（图1A）。采用选择水凝胶裂解法分离出水凝胶中的高密度mNSC，并采用matrigel包覆的2D培养法成功传代（图1B）。通过集落形成单元（CFU）实验，三种培养物均证实了mNSCs的自我更新能力（图1C、D）
图2 2D培养中分离的mNSC的免疫表型特征
分离的mNSCs通过SVZ和SGZ中以特异性的NSCs标记物表达（图2A)。流式细胞术分析显示，大量的mNSCs表达SOX2、巢蛋白、PAX6、DCX和Olig2。当使用大脑中存在的几种成熟细胞标记物来确认分离的mNSCs的纯度时，神经元、星形胶质细胞、平滑肌细胞和小胶质细胞/巨噬细胞的标记物只显示出很少的表达（图2B-D）。
图3 mNSC球状体的体外多重分化潜能和迁移能力
通过3D构建来考虑表型、粘附和代谢的影响。免疫荧光染色结果显示，2D单层条件下的mNSCs的微管蛋白、beta3III类（TUJ1）、微管相关蛋白2（MAP2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和Olig2均呈阳性（图3A）。在3D球形条件下，其表达水平升高。其中NeuN和S100B表达明显，提示终末分化的神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞或少突胶质细胞（图3B）。RT-PCR结果显示，分化的mNSCs在3D球状体条件下的mRNA水平升高（图3C）。mNSC SP具有连续迁移/入侵水凝胶的能力，利用转换后的8位图像的面积测量来估计迁移/入侵距离（图3D、E）。
图4 基于水凝胶的增强绿色荧光蛋白的mNSCs 3D组织工程
在本研究中，使用慢病毒增强的绿色荧光蛋白（EGFP）跟踪系统评估移植的mNSC球状体在损伤病变中的植入、分化和重建（图4A）。慢病毒感染3天后，大多数mNSCs显示GFP表达，没有形态学变化，并形成球状体（图4B）。根据每个细胞数的直径，确定球状体的最佳细胞数在1000~2000个细胞之间（图4C、D）。为了在大规模上生成均匀的球状体，推荐直径约为100 μm，根据细胞数量优化了培养条件（图4E）。作者观察了mNSC在水凝胶中的迁移和球状体之间的神经网络结构（图4F）。
图5 轻度TBI模型中mNSC球状片移植后mNSC的治疗效果
与TBI和原位凝胶小鼠相比，GFP阳性的mNSCs在损伤的皮质中存活了7、14和28 天，这表明通过mNSC球状体薄片移植可以防止大规模的细胞丢失（图5A、B）。在沿胼胝体的海马额叶区也观察到GFP阳性的mNSCs，表明其具有体内迁移能力（图5C）。宿主组织的皮质神经元和星形胶质细胞被整合并相互作用，引导移植的mNSCs的轴突生长（图5D）。mNSC SP片可以存活并支持神经元细胞在移植后28天内存活（图5E）。
图6 移植的mNSC球状薄片可减少轻度创伤性脑损伤模型中的认知障碍
在测量学习和记忆的NOR测试中，与mNSC SP组的mTBI小鼠在7 DPT和28 DPT时新物体探索的频率显著增加（图6A、B）。与使用mNSC SP组的mTBI或mTBI组相比，使用mNSC球状体薄片移植的mTBI小鼠在移植后7 、14和28 天，新物体探索的频率显著增加（图6A、B）。Y-迷宫试验还显示，与mNSC SPs移植组相比，使用mNSC球状体薄片移植组的mTBI小鼠在移植后7 天，新臂进入的交替数量显著增加（图6C、D）。这些数据表明，mNSC球状体薄片移植可能比mNSC SP移植更有助于改善认知损伤。
综上所述，本研究建立了一个在胶原/纤维蛋白水凝胶中来自成人mNSCs的NSCs的3D培养系统。胶原蛋白和纤维蛋白可以用于创伤后的中枢神经系统（CNS）修复，因为它们具有高度的生物相容性、可生物降解和无毒。本研究表明尽管存在恶劣的微环境，水凝胶mNSC球状体薄片的移植显示了损伤皮质病变中传递细胞的移植、迁移和稳定性。水凝胶mNSC球状片可以通过重建创伤性脑损伤后受损皮质，为受损认知功能的恢复提供有前途的治疗。
文章来源：
https://doi.org/10.1016/j.actbio.2023.06.027
