台盼蓝(Trypan Blue)染色法技术要点
想当年小编还是初入实验室的小白时，以为台盼蓝染色的效果应该是这样的（左），然而现实却是那样的（右）
不是说好的“金标准”吗？染成这样哪里还能准？
如果你是Nexcelom的粉丝，从往期文章中应该了解过台盼蓝染色法的局限性，以及当前最受认可的AO/PI荧光染核法的原理和优越性（参考小知识）。
细胞的死亡状态
在细胞实验中，我们一般会遇到两种类型的细胞死亡：一种是自然状态下的死亡，即细胞自身的老化或营养耗尽造成的死亡，通常会经历比较长的过程；另一种是诱导的瞬间死亡，比如药物处理、热水浴等，通常会在短时间内发生作用。两种不同状态的细胞死亡会让台盼蓝染色出现不同效果吗？
自然死亡
为了模拟细胞在自然状态下的死亡，研究者将Jurkat细胞放置在常温下，并在0，6，12，24，48，72，96和168小时后取出部分细胞和0.4%台盼蓝1：1混合染色。
从图片中我们可以看到，从0-12小时，死细胞大多被染成较深的蓝色；而从24小时起，我们会观察到一些浅蓝色呈弥散状态的物体（红色箭头）。对于这样的未知物，研究者们起了一个可爱的名字 – “气球” [1]。这些“气球“到底是什么呢？是细胞变的还是某种杂质？
在下面的小视频中，台盼蓝染料被缓缓加入在室温培养了168小时的Jurkat细胞。大家可以清楚地看到部分细胞被染成蓝色后迅速膨胀和破裂，染色随即变浅，细胞失去形态变成“气球“。整个过程仅几秒钟。
有视频为证，这些“气球“状物体就是死细胞的残骸。但当我们在显微镜下计数时，这些“气球”由于颜色太浅通常不会被计在内，因而导致死细胞的漏数和存活率的高估。研究者们将同样的样本用荧光核酸染料AO/PI或PI染色，并用Cellometer 细胞计数仪检测了所有样本的存活率。
从曲线图中可以看出，台盼蓝染色测得的细胞存活率（蓝色和红色曲线）总是高于荧光染料AO/PI和PI测得的存活率（绿色和紫色曲线）。当存活率高于80%时，台盼蓝和荧光染料测得结果间的差距较小；而当存活率低于80%时，两种方法测的结果间的差距会有显著差距，最高可达30%！因此我们强烈建议对于存活率低于80%的细胞样本应该用荧光染核法（比如AO/PI）检测细胞浓度和存活率[1]。
诱导的瞬间死亡
研究者们将Jurkat细胞分为两份，一份用沸水浴处理15分钟，一份不处理。处理过的细胞被认为0%存活，不处理的细胞被认为100%存活。将这两份细胞按比例混合得到存活率为0，25，50，75和100%的细胞样本。用0.4%台盼蓝或PI（碘化丙啶）荧光染料分别给样本染色并用Cellometer 细胞计数仪计数。
上图是预期存活率为100，50和0%的样本的染色效果。不同于自然死亡的细胞，热水浴诱导的死细胞台盼蓝染色后都变成了深蓝色，形态完整，没有出现“气球“状细胞。
此外，台盼蓝和PI染色测得的细胞存活率高度一致，也和预期存活率相当接近。为什么沸水浴处理的细胞和自然死亡的细胞在台盼蓝染色上会有这么大的区别呢？一个可能的原因是沸水浴增加了细胞膜的通透性但膜依然保持完整，使得台盼蓝可以渗入到死细胞中却不会向外扩散。
根据这些图片、视频和数据，研究者们提出了一个假设：细胞膜通透性增加而依然完整时，台盼蓝可以渗入并留在细胞内，细胞呈深蓝色并具有细胞形态；当细胞膜进一步破损时，渗入的台盼蓝会撑开细胞膜并扩散到周围，形成“气球”状物体，细胞形态随之消失[1]。简言之，此时的死细胞已经”Hold”不住台盼蓝了。
台盼蓝浓度
不同的台盼蓝浓度对细胞染色会有不同影响吗？Nexcelom的科学家们将同一Jurkat细胞样本与0.4%，0.2%，0.1%，0.05%和0.025%的台盼蓝以1：1比例混合，以下是部分浓度染色后的细胞图片：
下面的直方图统计了不同浓度台盼蓝检测到的死细胞（较深着色）和“气球”状细胞的浓度。
高浓度的台盼蓝更容易使死细胞破裂产生“气球“，而当”气球“颜色特别浅的时候容易被漏数。低浓度的台盼蓝不会产生”气球“状细胞，但过低的浓度可能不足以染上所有死细胞，使得检测不够灵敏。这两种情况都会导致死细胞被低估，即存活率被高估[1]。Nexcelom公司建议所有Cellometer用户使用0.2%的台盼蓝和细胞样本1：1混合后（终浓度0.1%）上机检测。
为了进一步研究不同浓度台盼蓝对细胞形态产生的影响，研究者分别用明场光学显微镜和相差显微镜对0.4%和0.1%台盼蓝染色的细胞进行拍照。
台盼蓝染色时间
台盼蓝是一种具有毒性的化学染料，若染色时间过长除了死细胞也会渗入活细胞，降低细胞的存活率。Mascotti等人在2000年发表的一篇文献中专门研究了台盼蓝和AO/PI对细胞的毒性[2]。作者们将HPC细胞和0.4%台盼蓝或AO/PI染料混合后放置在室温。在此后的2小时测量时间中，前一小时每隔10分钟取一次样计数，后一小时每隔15分钟取一次样计数。
上图记录了每个时间点两种方法测得的存活率。AO/PI（实心点）染色的细胞在2小时区间内始终保持很高的存活率（~98%），而台盼蓝（空心点）染色的细胞存活率从96.2%降到了89.8%。由此可见AO/PI对细胞的毒性非常小，而台盼蓝对细胞的毒性在2小时内已经十分明显。所以台盼蓝染色后需要尽快完成细胞计数，一般建议不要超过10分钟。
总结
综上所述，要想用台盼蓝染色做好细胞计数和存活率分析，必须
1）样本中杂质少，且存活率在80%以上；
2）死细胞的状态恰到好处，能”Hold”住台盼蓝；
3）台盼蓝浓度适中；
4）染色时间不超过10分钟。
如果无法同时满足这4个条件，那么赶紧使用以AO/PI为代表的荧光核酸染料吧。
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参考文献
1. Chan et al. Morphological observation and analysis using automated image cytometry for the comparison of trypan blue and fluorescence-based viability detection method. Cytotechnology. 2015 May;67(3):461-73.
2. Mascotti et al. HPC viability measurement: trypan blue versus acridine orange and propidium iodide. Transfusion. 2000 Jun;40(6):693-6.
