鼠尾血压监测仪助力黄芪-丹参药对干预自发性高血压鼠肾损害机制研究
山东中医药大学李伟团队在《中草药》期刊发表研究论文“基于miRNA测序技术探讨黄芪-丹参药对干预自发性高血压大鼠肾损害的机制研究”，从转录组学角度探索黄芪-丹参药对在自发性高血压大鼠肾组织中的直接作用靶点，探讨其改善高血压肾损害的作用机制。
摘要
目的
基于微小RNA（microRNA，miRNA）高通量测序技术，探讨黄芪-丹参药对通过调控miRNA改善高血压肾损害的作用机制。
方法
以9只WKY大鼠作为对照组，将自发性高血压大鼠随机分为模型组和黄芪-丹参药对（3.4 g/kg）组，每组9只；黄芪-丹参药对组给予黄芪-丹参药对进行干预，观察各组大鼠血压及肾组织病理变化，并对各组大鼠肾组织进行miRNA测序。
结果
经黄芪-丹参药对干预4周后，与模型组比较，大鼠血压降低（P<0.01），大鼠肾小球分叶不明显，系膜区增生减轻。与对照组相比，模型组共筛选出115个差异表达miRNA，其中68个差异表达miRNA上调、47个差异表达miRNA下调；与模型组相比，黄芪-丹参药对组筛选得到91个差异表达miRNA，其中67个差异表达miRNA上调、24个差异表达miRNA下调。差异表达miRNA的qRT-PCR验证结果显示，各组大鼠肾组织miRNA-142-5p、miRNA-3585-5p、miRNA-219a-5p、miRNA-122-5p和miRNA-125b-1-3p表达与miRNA测序结果趋势一致。差异表达miRNA的靶基因预测及功能富集结果显示，基因本体（GO）功能主要富集于阴离子跨膜转运、突触前、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性等方面；京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路主要富集于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、自噬、单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）信号通路等途径。结论 miR-219a-5p、miR-3585-5p和miR-142-5p可能是黄芪-丹参药对延缓高血压肾损害进程的直接靶点。
实验材料与仪器
实验动物：24周龄SPF级雄性自发性高血压大鼠18只，同周龄WKY大鼠9只
药品与试剂：2 g黄芪中药配方颗粒、1 g丹参中药配方颗粒、QIAseq miRNA Library Kit、miRNeasy Mini Kit、MiPure Cell/Tissue miRNA Kit、Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit、TB GreenTM Ex TaqTM II Kit
仪器：IITC MRBP鼠尾血压监测仪、光学显微镜、分光光度计、生物分析仪、测序仪
IITC MRBP鼠尾血压监测仪
实验方法与步骤
动物分组与给药：取WKY大鼠9只作为对照组，将自发性高血压大鼠随机分为模型组和黄芪-丹参药对（3.4 g/kg）组，每组9只。根据课题组前期研究，黄芪、丹参饮片用量分别为5.09、2.55 g/kg，分别将黄芪、丹参配方颗粒用量定为2.036、0.255 g/kg，药物以0.9%氯化钠溶液溶解。各给药组灌胃给药（10 mL/kg），对照组和模型组灌胃等体积0.9%氯化钠溶液，1次/d，连续4周。
血压测量：每周采用无创尾动脉加压法测量血压，记录每只大鼠清醒状态下尾动脉的收缩压与舒张压，连续测量3次。
肾组织病理观察：给药结束后，大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠（80 mg/kg）过量麻醉处死，取肾组织，于中性多聚甲醛中固定48 h，切片（厚4 μm）后石蜡包埋，进行苏木素-伊红（HE）染色，以中性树胶封片，于显微镜下观察并拍照。
miRNA测序：随机选取各组大鼠各3只，提取肾组织RNA并进行质量检测和定量分析。使用QIAseq miRNA Library Kit构建双端测序文库，在Illumina Hiseq Xten测序平台上测序。将每个具有miRNA序列的样品读长与已有miRNA数据库和新miRNA的预测结果进行比较，计算miRNA表达水平，使用DESeq软件分析样品miRNA表达并筛选出P<0.05、倍数变化（FC）>1.5或<0.67的差异表达miRNA。
qRT-PCR验证：选择5个差异表达miRNA（miRNA-142-5p、miRNA-3585-5p、miRNA-219a-5p、miRNA-122-5p、miRNA-125b-1-3p）进行qRT-PCR验证。以U6为内参，按照试剂盒说明书进行检测。
靶基因预测及网络构建：利用miRNA算法从miRNA-mRNA序列匹配情况及能量稳定性方面综合预测差异表达miRNA靶基因，运用Cytoscape软件构建差异表达miRNA与相应靶基因的网络图。
研究结果与分析
肾组织病理变化：对照组肾小球体积正常，系膜区未见明显增生，系膜基质正常，未见肾小球硬化，肾小管上皮细胞形态正常；模型组肾小球体积轻度增大，分叶明显，系膜区增生，系膜基质增多，伴中性粒细胞及其他炎性细胞浸润，轻度肾小管萎缩；黄芪-丹参药对组肾小球体积轻度增大，分叶不明显，系膜区轻度增生，伴轻度中性粒细胞和其他炎性细胞浸润。
GO功能富集分析：与对照组相比，模型组GO功能富集程度最高的分别为阴离子跨膜转运、突触前、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性。与模型组相比，黄芪-丹参药对组GO功能富集程度最高的分别为Ras蛋白信号转导、囊泡膜、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性。
KEGG通路富集分析：与对照组相比，模型组差异表达miRNA靶基因主要富集于mTOR信号通路、MAPK信号通路、自噬、AMPK信号通路、FoxO信号通路、TGF-β信号通路等途径。与模型组相比，黄芪-丹参药对组差异表达miRNA靶基因主要富集于MAPK信号通路、mTOR信号通路、自噬、AMPK信号通路、TGF-β信号通路、Ras信号通路等途径。
总结
该研究通过miRNA高通量测序技术，在自发性高血压大鼠模型中鉴定出黄芪-丹参药对干预后91个差异表达miRNA，其中miR-219a-5p、miR-3585-5p和miR-142-5p在模型组表达上调、药对组表达下调，提示这三个miRNA可能是黄芪-丹参药对延缓高血压肾损害进程的直接靶点。KEGG通路分析显示，黄芪-丹参药对可能通过调控mTOR、MAPK、自噬、AMPK、TGF-β等信号通路发挥作用。该研究为高血压肾损害的机制研究和中药防治提供了依据。
原文链接
https://www.tiprpress.com/zcy/article/abstract/20211814
参考文献
[1] 韩聪，姜月华，李伟. 黄芪-丹参药对改善高血压肾损害的研究进展 [J]. 中国实验方剂学杂志，2019，25(12): 214-220. http://doi.org/10.13422/j.cnki.syfjx.20191242
[2] Ding S, Liang Y S, Zhao M, et al. Decreased microRNA-142-3p/5p expression causes CD4+ T cell activation and B cell hyperstimulation in systemic lupus erythematosus [J]. Arthritis Rheum, 2012, 64(9): 2953-2963. http://doi.org/10.1002/art.34505
