文库片段筛选技术流程

磁珠进行核酸片段筛选的步骤基于SPRI技术和磁场分离原理，通过磁珠与DNA片段的特异性结合实现目标片段的分离。以下是具体操作流程及关键要点： 一、实验准备

1. ​磁珠平衡
   将磁珠从冰箱取出，室温平衡至少30分钟，避免低温破坏表面修饰基团。
2. ​试剂配制
   • 现用现配80%无水乙醇（体积比8:2）。
   • 根据目标片段大小选择磁珠比例（参考各厂家磁珠分选比例表）。

二、双轮分选法（适用于NGS文库构建）
​第一轮：去除大片段（右侧清除）​

1. ​磁珠与样本混合
   按比例（如0.8×）加入磁珠至DNA溶液中，涡旋混匀或移液器吹打10次，室温孵育5分钟。
2. ​磁场分离
   短暂离心后置于磁力架（如达远辰光磁力架），待溶液澄清（约5分钟），转移上清至新管，残留2μL液体于原管底部，避免吸到磁珠。

​第二轮：去除小片段（左侧清除）​

1. ​加入第二轮磁珠
   按比例（如0.2×）加入磁珠至第一轮上清中，重复混匀、孵育步骤。
2. ​磁场分离与洗脱
   • 分离后弃上清，用80%乙醇漂洗磁珠2次（每次30秒）。
   • 室温干燥磁珠至刚出现龟裂（约5分钟），避免过度干燥。
   • 加入ddH₂O或TE洗脱DNA，室温孵育5分钟后回收上清。

三、单侧分选法（适用于去除短片段）

1. ​调整磁珠比例
   根据目标片段长度选择磁珠用量（如去除≥1000bp片段用0.6×，去除≥200bp用2.0×）。
2. ​结合与分离
   • 混匀磁珠与样本后孵育5分钟，磁力架分离并弃上清。
   • 乙醇漂洗后洗脱DNA，适用于去除引物二聚体或短片段杂质。

四、关键注意事项

1. ​分选精度控制
   • 第一轮弃磁珠，第二轮弃上清，确保目标片段被保留。
   • 使用Qsep、Agilent 2100 Bioanalyzer验证分选后片段分布。
2. ​操作误差规避
   • 转移上清时使用200μL+10μL枪头，防止吸到磁珠。
   • 初始体积≥100μL，不足时补超纯水以减少移液误差。

五、应用场景示例

• ​NGS文库构建：通过双轮分选获得300-500bp目标片段。
• ​病原体检测：快速分离特定长度的病毒核酸片段。

如需具体磁珠比例表或实验参数，可参考厂商提供的说明书（如UltraBio™ II DNA磁珠分选指南）。