English | 中文版 | 手机版 企业登录 | 个人登录 | 邮件订阅
高级搜索
当前位置 > 首页 > 技术文章 > 生物打印肝脏模型在评价药物的肝脏毒性研究的应用
生物打印肝脏模型在评价药物的肝脏毒性研究的应用
点击次数:592 发布日期:2022-6-1  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

背景介绍 


 

药物性肝损伤(DILI)会影响肝脏代谢和解毒能力,但其根本机制仍有很多未知。为了准确和可再现地预测人的DILI,非常需要体外肝脏模型来替代昂贵和低通量的2D细胞培养系统、动物研究和芯片实验室模型。我们提出了一种新的“droplet in droplet”(DID)生物打印方法,该方法可以产生用于肝毒性研究的生理相关肝脏模型。这些模型,或称微型肝脏,是用BIO X微滴打印包裹在ⅰ型胶原中的肝(HepG2和LX2 肝星状细胞)和非肝(HUVEC 人脐静脉血管内皮细胞)细胞制成的。培养7天后,将微型肝脏暴露于急性和高剂量的对乙酰氨基酚或氟他胺,然后评估细胞活力、白蛋白分泌、丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性和脂质积累的变化。微型肝脏ALT活性增加,白蛋白和脂质生成减少,表面这两种药物均有细胞毒性反应。这项研究的结果进一步验证了3D生物打印是一种可行的、可用于模拟肝组织和筛选特异性药物反应的中到高通量的解决方案。
 

 材料和方法 

细胞准备

根据建议的方案培养两种肝细胞(HepG2和LX2)和一种非肝细胞(HUVEC)细胞系,并每3-4天传代一次。HepG2在含有谷氨酰胺的MEMα中生长,并补充1%丙酮酸钠(Gibco,Cat#11360070)和1%MEM非必需氨基酸溶液(Gibco,Cat-#11140050)。LX2细胞在IMDM(Gibco,Cat#12440053)中生长,HUVEC在EGM-2生长培养基(Lonza,Cat#CC-3156)中培养,并添加单体补充剂(Lonza,Cat#CC-4176)。所有培养基均添加10%的FBS(Gibco,16000044类)和1%的青霉素链霉素(Gibco,参考文献1509-70-063)。
 

生物墨水的制备和DID生物打印

中和并制备3mg/mL浓度的Coll I bioink(CELLINK,SKU#IK4000002001)用于生物打印。以1:1:2(LX2:HUVEC:HepG2)的比例将5x106个细胞/毫升装入冷冻墨盒。在未经处理的96孔板(Thermo Fisher Scientific)中,使用BIO X(CELLINK,SKU#0000000 2222)上的液滴打印功能对微型肝脏进行生物打印。使用设置为8°C的温控打印头(TCPH,SKU#0000000 20346)将胶原液滴分配到设置为8°C–10°C的冷却打印床上。在第一轮液滴打印后,样品在37°C下培养3分钟,然后返回BIO X,使用相同参数进行第二轮液滴打印。在37°C条件下,将得到的封装液滴热交联20分钟,并为每个孔提供200微升混合培养基(25%IMDM+25%DMEM+50%MEM)。培养液每2-3天更新一次。
 


 

药物处理和分析

培养7天后,用不同浓度的APAP[0.1,0.5,1,5,10,25,50 mM](Abcam)或FLU[10,25,50,75,100,150,200µM](Selleckchem)处理微型肝脏72小时。采用比色溴甲酚绿(BCG)测定法(Sigma-Aldrich)、ALT活性测定法(BioVision)和活/死染色试剂盒(Invitrogen)分别检测白蛋白产生、肝损伤和细胞活力。所有分析均按照制造商的说明进行。
 

 结论 

胶原I中的细胞生长和球体形成

胶原I中的细胞生长和球体形成在这项研究中,我们评估了Coll I bioink中的细胞生长、球体形成和迁移模式。到第2天,HepG2和LX2已紧密组装成小簇,HUVEC已拉长,形成同心网络(图1)。使用胶原蛋白作为支架可以在整个培养过程中进行细胞重组、球体极化和细胞增殖(数据未显示)。此外,根据图1,很明显,细胞在整个培养过程中渗透DILI模型,并可能在内部和外部液滴层之间迁移。
 


生物打印微型肝脏的药物治疗和细胞毒性

第10天的毒性评估结果表明,生物打印微型肝脏对APAP(图2A)和FLU(图2B)具有细胞毒性和剂量依赖性反应。这种肝功能下降表现为白蛋白分泌和脂质生成减少,ALT活性上调。同样明显的是,基于ALT活性的增加,两种药物的毒性剂量都会对细胞活力产生破坏性影响。后者在图3中尤为明显,其中活/死图像表明,在较高浓度的APAP或流感病毒下,细胞活力显著降低。
 


药物治疗的动态细胞内反应

研究了APAP和FLU如何调节细胞内脂肪含量。肝组织的ORO染色通常用于识别脂肪酸或药物引起的不同阶段纤维化或脂肪变性(Pingitore,2019)。在我们的研究中,经处理的微型肝脏的ORO染色显示,在高剂量药物处理的样本中,脂肪积累最小,而在未经处理或低剂量药物治疗的样本中,脂肪积累显著(图4A)。一种解释是APAP和FLU与脂质过氧化有关,其中毒性药物水平引起的氧化应激可能引发脂质降解和膜损伤(Behrends,2019)。图4B中未处理样品的详细观察提供了液滴模型中液滴的横截面图。这张图片显示了大量细胞向液滴外壳迁移并产生脂肪,可能表明存在营养和氧气梯度,并验证了细胞重组模式和胶原内的球体极化。
 

▶  作为2D细胞培养系统、动物研究和芯片实验室原型的可靠替代品,BIO X可作为中高通量工具,用于制作功能性3D生物打印肝脏模型,实现药物筛选和分析,并减轻药物消耗的成本。

▶  CELLINK Coll I作为DID模型的支架,为模型提供了一个稳定、可调和高度相容的环境,且具有丰富的肝细胞重排和球体形成的结合位点。

▶  基于脂质过氧化、白蛋白分泌减少和ALT活性上调的证据,我们的研究结果表明,DID微型肝脏具有功能性,并且对APAP和FLU具有剂量依赖性和细胞毒性反应。

▶  DID模型允许组织层之间的细胞间相互作用,并为研究不同硬度层之间的迁移模式提供了独特的机会。未来的毒性研究可以采用该模型复制纤维化的各个阶段,或研究药物治疗后肝脏组织的再生能力。

 

参考文献:

1.Behrends, V., Giskeødegård, G. F., Bravo-Santano, N., Letek, M., & Keun, H. C. Acetaminophen cytotoxicity in HepG2 cells isassociated with a decoupling of glycolysis from the TCA cycle, loss of NADPH production, and suppression of anabolism. Archivesof Toxicology. 2019; 93(2): 341–353. DOI: 10.1007/s00204-018-2371-0.

2.Chen, M., Suzuki, A., Borlak, J., Andrade, R. J., & Lucena, M. I. Drug-induced liver injury: Interactions between drug properties andhost factors. Journal of Hepatology. 2015; 63: 503–514. DOI: 10.1016/j.jhep.2015.04.016.

3.Pingitore, P., Sasidharan, K., Ekstrand, M., Prill, S., Lindén, D., & Romeo, S. Human multilineage 3D spheroids as a model of liversteatosis and fibrosis. International Journal of Molecular Sciences. 2019; 20(7): 1629.

来源:北京深蓝云生物科技有限公司
联系电话:010-57256059
E-mail:info@cycloudbio.com

用户名: 密码: 匿名 快速注册 忘记密码
评论只代表网友观点,不代表本站观点。 请输入验证码: 8795
Copyright(C) 1998-2022 生物器材网 电话:021-64166852;13621656896 E-mail:info@bio-equip.com