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利用近红外标记和图像及数据分析提高Cell Painting的可靠性
点击次数:412 发布日期:2022-4-14  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负


简介
基于图像的表型分析方法,如广泛使用的 Cell Painting分析,使用高内涵成像和多参数输出来研究细胞中的生物、遗传和化学扰动。这种日益流行的方法正被应用于从药物发现项目到基因组筛选研究。在标准的 Cell Painting 实验中,各种细胞器和结构 ( 细胞核、细胞质、线粒体、高尔基体、内质网、细胞骨架、胞质 RNA 和核仁 ) 在 5 个成像通道中被采集。这种广泛的细胞染色能够以单细胞分辨率对多种形态的扰动进行监测和定量。已发表的 Cell Painting 分析的局限性包括适合的染料可用性狭窄以及成像系统提供足够的光谱分离能力。具体来说,高尔基体和肌动蛋白是通过同一通道成像的,这就给图像分析中区分这两个结构带来了挑战。这种限制可能会干扰 hit 的选择或掩盖某些化合物的效果,特别是那些具有影响高尔基体 ( 生物合成途径 ) 或细胞骨架网络的作用机制 (MOA) 的化合物。

优势
• 使用近红外标记提高 Cell Painting 分析的灵敏度。
• 使用 IN Carta 的深度学习 SINAP 模块获得可靠的图像分割。
• 结合 StratoMineR 的基于云的数据分析软件易于使用。
 
在这里,我们试图利用配备近红外光源的 ImageXpressConfocal HT. ai 高内涵成像系统来改进检测方法。我们将 Alexa Fluor 568 Phalloidin 替 换 为 Alexa Fluor 750Phalloidin,使细胞骨架与高尔基区域明显分离。
 
由于这种多色分析的复杂性,从这些图像分析中产生的庞大数据需要额外的分析工具来帮助挖掘和解释数据。为了便于管理图像和数据分析,我们使用 IN Carta 图像分析软件进行特征提取,然后使用 HC StratoMineR 进行数据挖掘和分析。IN Carta 具有深度学习功能,允许更可靠的特征分割。因此,当与深度学习的 SINAP 模块一起使用时,Cell Painting 分析将受益于改进的细胞核检测。此外,如线粒体、内质网、高尔基体和细胞骨架等细胞器可以在需要时使用深度学习功能进一步分割。可以从分析的
图像中提取包含荧光强度、空间数值、纹理、细胞器分布和共定位测量。然后将数据上传到 HC StratoMineR,这是一个直观的基于云的数据分析平台,用于进一步的数据分析。为了确定我们的方法是否比标准的 Cell Painting方法有任何优势,我们比较了用 5 通道获得的图像和用 6通道获得的图像之间的表型距离得分。

我们发现,用一组化合物处理的细胞的距离得分提高了49%。这些结果表明,对高尔基体和细胞骨架使用单独的成像通道增加了 Cell Painting 实验的敏感性,并更有力的代表了不同的细胞表型特征。
 
方法
1. U2OS 细胞 (ATCC) 以每孔 2000 个细胞接种。
2.在四个复孔中,以 7 个数据点 1:3 系列稀释和合适的对照品对 11 种化合物进行了测试。使用的化合
物 :Ca-074-Me、CCCP、氯喹、细胞松弛素 D、依托泊苷、拉春库林 B、雷帕霉素、鱼藤酮、十字孢碱、紫杉醇、粉防己碱。
3.细 胞 染 色 采 用 Bray 等 人 的 方 法1 。对 于 改 进 的 方案,使 用 phalloidin/Alexa Fluor Plus 750 (ThermoFisher) 代替 phalloidin/Alexa Fluor 568。
4.图像采集在使用 20X Plan Apo 物镜的 ImageXpressConfocal HT.ai ( 基于激光 ) 或者 ImageXpress MicroConfocal ( 基于 LED) 的高内涵成像系统 (MolecularDevices) 上进行。 使用的滤光片如表 1 所示。
5.图像分析采用 IN Carta 图像分析软件。所选择的测量包括与强度、纹理、形状、空间关系和共定位分数相关的参数。
6.细胞水平的数据被上传到 StratoMineR (https://cla.stratominer.com/index.php, Core Life Analytics)进行进一步的数据分析。 简要地说,采用了质量控制、孔归一化、数据转换和特征标准化。使用主成分分析(PCA) 对数据集进行降维。进一步的下游分析,如进行基于主成分和表型距离得分的 hit 选择和聚类分析。

结果
图像采集
Cell Painting 实验使用六种荧光标记同时标记细胞,然后对各种细胞结构进行成像。高尔基体 ( AGP 通道 ) 和细胞骨架均使用相同的滤光片组成像 ( 表 1,图 1 )。这些亚细胞结构的解析通常在图像分析步骤中进行。在我们的模型实验中,用 11 种化合物处理 U2OS 细胞 24 小时,然后再
根据之前发表的方法进行。1、2 然后使用 5 个成像通道对细胞进行成像 ( 图 1 )。
 
为了从细胞骨架中分离出高尔基体结构,我们修改了检测方法,将 Alexa Fluor 568 Phalloidin 换成 Alexa Fluor 750Phalloidin,并使用配备了近红外光源的 ImageXpressConfocal HT. ai 高 内 涵 成 像 系 统 对 细 胞 进 行 成 像 ( 图2A ) ( 以下简称改进的检测 )。用这种方法,可以在未经处理的细胞中清楚地看到高尔基体结构在核周分布。当WGA( 高尔基体 ) 和鬼笔环肽 ( 肌动蛋白 ) 染色在同一通道成像时,这种分布不易区分 ( 图 1 )。这种差异在化合物( 如粉防己碱 ) 处理的细胞中更为明显 ( 图 2B )。


     
 
图 2 Cell Painting 实验改进使用远红外光源的改良方案,以改善 Cell Painting 实验中的光谱分离。 A)Phalloidin Alexa Fluor 750 用于在改良方案中标记肌动蛋白。显示了来自对照孔的示例图像。插图 ( 白色框 ) 被放大,显示为细胞核 ( 蓝色 ) 和高尔基体通道 ( 黄色 ) 的合成图。高尔基斑点明显分布在核周组织中。B) 细胞用粉防己碱处理的图像。左边是肌动蛋白和高尔基体通道叠加的重建图像 ( 黄色 )。右边显示只有高尔基体 ( 黄色 ) 和细胞核 ( 蓝色 ) 的图像。改良方案中粉防己碱对高尔基体分布的影响更为明显 ( 右 )。C) 激光光源及其相对功率显示。标示展示了各个光源检测的细胞区域。

特征提取和数据分析
为了量化标准 cell paint 染料组与改良染料组染色的细胞之间的差异,在 IN Carta 图像分析软件中分析图像 ( 图3 )。提取的测量数据上传到 HC StratoMineR 进行进一步的数据分析。从标准 Cell Painting 实验与改良实验提取的数据执行主成分分析 (PCA)。有趣的是,AGP 通道的测量构成了 PCA 1 中 5 通道图像的大部分特征成分。然而肌动蛋白通道的测量构成了 PCA 1 中改良后的 6 通道图像的大部分主要特征 ( 图 4 )。这表明,改进的分析方法可以提高肌动蛋白和高尔基体组分之间的表型图谱的分辨率,这对了解 MOA 是有用的。
 
我们还根据距离评分比较了标准和改良 Cell Painting 实验之间的表型特征。该分数表示一个样本与阴性对照之间的表型距离,可用于筛选实验中的 hit 选择。我们发现已知影响高尔基体通路的化合物的距离分数有所增加( 表 2 )。这些结果表明,对高尔基体和细胞骨架使用单独的成像通道增加了 Cell Painting 实验的敏感性,并更有力地代表了细胞表型特征。
图 3 在 IN Carta 软件中进行特征提取,对各种细胞结构进行分割。在这里,内置的细胞核模型被用来在所有处理中实现核的稳定分割。对于 6 通道采集的图像,每个细胞提取 487 个特征。这里展示的是在 IN Carta 软件中带有特征掩模叠加的示例图像。
图 4 使用 HC StratoMineR 进行数据分析。A) HC StratoMineR 是一个基于网页的平台,引导用户通过一个典型的工作流分析高内涵的多参数数据。B) 用 PCA( 广义加权最小二乘法 ) 将数据减少到 15 个成分。特征对 PCA1 的贡献显示为一个极线图。根据它们所代表的细胞区域,用特征颜色编码。PCA1 特征从 5 通道 ( 上 ) 和 6 通道 ( 下 ) Cell Painting 采集。请注意特性的贡献有所不同。
 
总结
•我们的结果表明,使用近红外激光提高了 Cell Painting检测的灵敏度。在这种情况下,它允许开发一种分离高尔基体表型更敏感的分析方法。
• 额外的通道还允许通过添加项目特定的生物标记物来扩展标准的 Cell Painting 分析。
 
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参考文献
1. Bray MA et.al., Nat Protoc. 2016 Sep;11(9):1757–74.
2.Gustafsdottir SM et.al., PLoS One. 2013 Dec 2;8(12):e80999.
3.Omta WA, et.al., Assay Drug Dev Technol. 2016 Oct;14(8):439–452.
 
 
 
 
 
 
来源:美谷分子仪器(上海)有限公司
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