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蛋白质含量测定三种常用的方法及注意事项
点击次数:954 发布日期:2022-1-18  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
Protein Engineer对很多人来说,检测蛋白质的浓度实在不是多困难的实验。但有时我们也不能太过自信,因为即使最简单的方法都有其复杂的机理。为了帮助大家选择正确并且简单的方法测定蛋白质的浓度,小编在这里简单介绍下三种常用的蛋白质含量测定方法的原理及注意事项。

一、BCA(Bicinchoninic Acid)法
BCA方法是近年来广泛应用的蛋白质定量方法。其原理是,在碱性环境下蛋白质与二价铜离子络合并将二价铜离子还原为一价铜离子。BCA与一价铜离子结合形成稳定的蓝紫色复合物。该复合物在562 nm处有较高的吸光值,并与蛋白质浓度呈正比。不方便的是这种方法需要提前制作标准曲线。BCA蛋白质测定方法灵敏度高,操作简单,试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳。BCA方法适用于表面活性剂存在下的蛋白质浓度检测,可兼容高达5%的SDS,TritonX-100及Tween等。然而,由于BCA方法依靠铜离子进行显色反应,如果溶液中含有与铜离子反应的螯合剂比如EDTA或者还原性试剂比如DTT、β-巯基乙醇,结果将受到很大程度的影响。同时,BCA方法的检测结果也会受到蛋白质内半胱氨酸,酪氨酸,色氨酸含量的影响。

二、Bradford法
Bradford方法是由Bradford于1976年建立的。第一篇描述Bradford方法的文献目前已经被引用数千次,这充分说明了Bradford方法的价值。该方法的原理是,带负电的考马斯亮蓝染料与蛋白质中碱性氨基酸相互作用。考马斯亮蓝在溶液中显红色,吸收峰在465nm处,当与蛋白质结合后,其显蓝色,在595nm处有吸收峰。595nm处的吸光值与蛋白质的浓度呈正比。在应用Bradford方法时有一些注意事项,如下:

1、利用Bradford方法制作的标准曲线并非是直线
上图标准曲线采用赛默飞Bradford蛋白质检测试剂盒(Cat:23200),BSA作为标准品制作。从图中可知BSA作为标准品制作的标准曲线,线形部分只在0.1-1.4 mg/mL浓度区间内。因此需要将待测蛋白质浓度稀释或浓缩至这一浓度区间,方可利用线形拟合的公式计算蛋白质浓度。另外,有必要在每次实验时都进行标准曲线的制作。

2、高浓度去垢剂影响Bradford方法的准确性
对Bradford方法有干扰的试剂及其浓度可以从BioEngX分享的protocol中了解,平台回复Bradford可获得protocol下载链接。这里列举几个常用的试剂及Bradford方法最大兼容浓度:SDS,最大兼容浓度为0.125%; Tween-20(80), 最大兼容浓度0.061%;咪唑(pH 7.0) , 最大兼容浓度200 mM; HEPES(pH 7.5),最大兼容浓度100 mM。值得一提的是咪唑,利用镍柱纯化蛋白质时,洗脱缓冲溶液中有高浓度的咪唑,因此在利用Bradford对纯化蛋白质进行定量前,必须要对洗脱蛋白质进行脱盐处理。 值得第二提的是,不像BCA方法,Bradford方法与还原性试剂是兼容的。当你需要在蛋白质中添加DTT 等还原性保护试剂时,不要犹豫,Bradford是你绝佳的选择。

3、可利用除了595 nm以外的波长进行检测
Bradford方法能够利用96孔板检测体积低至5 μL的蛋白质浓度,然而很多plate reader不具备595 nm的滤光片。这里要说明的是,蛋白质与染料产生的蓝色复合物可以利用570-610 nm之间的任何波长检测到。只不过,利用除了595 nm以外的波长制作的标准曲线的斜率会比595nm下的标曲斜率小,同时最低检测限也会有所提高。

三、紫外分光光度法
简单但常常不可靠。这个方法通过测量蛋白质中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸在280nm处吸光值来估测蛋白质的含量。蛋白质浓度根据Beer-Lambert定律计算。
                  

A=E•C•l
A代表吸光度,E代表消光系数,C代表蛋白质浓度,l代表光径长度。消光系数可以根据蛋白质序列估测。这种方法之所以不可靠有两个原因。
第一,不同的蛋白质含有不同的酪氨酸和色氨酸含量。故要准确测量,必须要有待测蛋白质的纯品作为参考。
另外,这种方法会受到在280 nm处有吸光值的物质的影响,包括一些buffer离子,核酸,乙醇等等。其中尤以核酸的影响最为严重。核酸的最大吸收峰在260 nm。因此溶液中同时存在核酸时,必须同时测定OD260和OD280,然后根据两种波长的吸收度的比值,通过经验公式校正,以消除核酸的影响。本法操作简单迅速,且不消耗样品,多用于纯化的蛋白质的微量测定。
来源:上海博湖生物科技有限公司销售部
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