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细胞容易污染的解决与测定方法
点击次数:1341 发布日期:2021-11-26  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

很多老师在进行细胞培养实验时,细胞总是会莫名其妙的就被污染了,同样的实验人员,同样的环境,同样的培养体系,可是细胞还是有污染。
试剂、耗材已经使用控制变量法进行过排查,那么还有什么方面可能会导致污染呢?

 ———— 细胞房环境污染(空气中的沉降菌)

 

Vol.1
有关沉降菌的术语与定义

沉降菌
通过使用专门的培养基,并按照以下标准提及的方法,收集空气中的活微生物粒子,在适宜的条件下,繁殖到肉眼可见的菌落数。通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿,经若干时间,在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数,以平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境内的活微生物数,并以此来评定洁净室(区)的洁净度。

沉降菌菌落数
规定时间内每个平板培养皿收集到空气中沉降菌的数目,以个/皿表示。

静态a
洁净室(区)在净化空气调节系统已安装完毕且功能完备的情况下,生产工艺设备已安装、洁净室(区)内没有生产人员的状态。

静态b
洁净室(区)在生产操作全部结束,生产操作人员撤离现场并经过20min 自净后。

动态
洁净室(区)已处于正常生产状态,设备在指定的方式下进行,并且有指定的人员按照规范操作。


标准:
1. GB/T 16292-2010 《医药工业洁净室(区)》悬浮粒子的测试方法》
2. GB/T 16294-2010 《医药工业洁净室(区)》沉降菌的测试方法》

 


Vol.2
如何进行检测

1. 实验准备
试剂:大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)


图1. 大豆酪蛋白琼脂培养基

仪器:恒温培养箱(需定期对培养箱进行校验,最好每年一次)
检测目标:生物安全柜、细胞房、开放环境、人手指等

2. 采样点数目及布置
最少采样点数:

注:常规超净台或安全柜洁净度级别:100级;常规细胞房洁净度级别:10000级

 

布置要求:
采样点布置宜力求均匀,避免采样点在局部区域过于稀疏;细胞房、安全柜、超净台建议下列布置图:


图2.平面采样点布置图


参照医药工业洁净室沉降菌的测试方法细胞房、安全柜、超净台建议布置图中,我们选取五点取样法。(大家可根据实验室情况进行选择,具体没有规定限制取样布置图)


图3. 生物安全柜布置图
 

最小培养皿数:

注:常规超净台或安全柜洁净度级别:100级;常规细胞房洁净度级别:10000级;这里的最小培养皿数是所有采样点皿数总和。

3. 生物安全柜、细胞房及开放环境测试步骤

 

生物安全柜

① 选择状态:
●  静态a测试时:生物安全柜应开机运行不少于10min;细胞房净化空气调节系统正常运行时间不少于30min后开始。 
●  静态b测试时:生物安全柜宜在操作人员撤离现场并经过10min自净后开始;细胞房宜在操作人员撤离现场并经过20min自净后开始。
●  动态测试:则须记录生产开始的时间以及测试时间。


② 培养皿表面必须严格消毒,将培养皿按采样点布置图逐个放置,然后从里到外逐个打开培养皿盖(避免人衣物上微生物的掉落干扰实验),使培养基表面暴露在空气中。
●  静态测试时,培养皿暴露时间在30min以上,室内测试人员不得多于2人。

●  动态测试时,培养皿暴露时间为不大于4h。

细胞房
③ 若细胞房的房型及器材摆放并不适合采用标准的五点取样法。因此可以选取较容易污染的点进行测试
 


图4. 桌面



图5. 离心机



图6. 显微镜
 


图7. 培养箱
 


图8. 传递窗

开放环境

图9. 开放环境桌面放置
 

④ 全部采样结束后,收样时需从外到里逐个盖上培养皿盖(同样避免人衣物上微生物的掉落干扰实验),做好相应标记后将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养,培养时间不少于48h。
⑤ 每批培养基应有对照试验,检查培养基本身是否污染。可选定每批3只培养皿不打开作对照培养。

4. 阳性对照测试
为避免无阳性对照,我们邀请技术同事将手指点涂在培养基上进行阳性对照实验。两天后可明显观察到菌落的生成。


图10. 手指部位阳性对照组


图11. 手指部位阳性对照组(放大图)

肉眼可以观察到明显的菌落形成,成片的是菌落重叠生长聚集在了一起,很难分辨出具体有多少个菌落。
※  平时我们的手上会携带大量的菌



Vol.3
测试结果判定

可直接观察:




图12. 批次对照组

由图可以看出对照组都未长菌。




图13. 生物安全柜污染点取样
可以看出生物安全柜无污染。



图14. 细胞房以污染点取样

由图可以看出我公司细胞房内洁净程度达标,无污染。

 


图15. 开放环境桌面取样
开放环境下,肉眼可以看到有菌落形成
 

菌落计数:
●  用肉眼对培养基上的所有菌落直接计数、标记或在菌落计数器上点计,然后用5~10倍放大镜检查,有否遗漏。
●  若培养皿上有2个或2个以上菌落重叠,可分辨时仍以2个或2个以上的菌落计数。
●  平均菌落的计算,如下:

 平均菌落数M=(M1+M2+...Mn)/n


M为平均菌落数;M1为1号培养皿菌落数;Mn为n号培养皿菌落数;n为培养皿
 

 
结果评定:
计算后需要对结果进行评定,不同国家对不同洁净度级别规定的平均菌落数不同。

注:a为培养皿暴露时间不超过4h,以平均菌落数表示
常规超净台或安全柜洁净度级别:100级;常规细胞房洁净度级别:10000级



Vol.4
注意事项及监测频率

注意事项:
★  测试用具要做灭菌处理,以确保测试的可靠性、正确性
★  采取一切措施防止人为对样本的污染。
★  对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。
★  由于细菌种类繁多,差别甚大,计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察,不要漏计培养皿边缘生长的菌落,并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别,必要时用显微镜鉴别。
★  采样前应仔细检查每个培养皿的质量,如发现变质、破损或污染的应剔除。
★  沉降菌检测使用的大豆酪蛋白琼脂培养基不一定适养支原体,所以不代表无支原体污染。

监测频率:
★  如果生物安全柜所处的环境为十万级洁净区,可每三个月测试一次;
★  如果生物安全柜所处的环境为万级洁净区,至少每个月监测一次沉降菌;
★  如果沉降菌连续几次监测不合格,则考虑更换生物安全柜的高效过滤器。

 


 

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