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DNA提取试剂盒的工作原理及DNA提取中常见问题
点击次数:1987 发布日期:2021-11-25  来源:苏州阿尔法生物实验器材有限公司
不了解 DNA 提取试剂盒的工作原理?我们在本文中介绍了基础知识,因此您可以完善您的核酸分离并获得高质量的 DNA。
 
DNA提取是分子生物学实验中必不可少的寄出实验步骤。因为我们在分子生物学中所做的几乎所有事情在开始都需要 DNA 或 RNA,无论是 qPCR、分子克隆、下一代测序还是其他任何东西。 
如今,大多数实验室都使用商业 DNA 提取试剂盒,这些试剂盒使用硅胶自旋过滤法来获得高质量的 DNA。这些可以快速有效地纯化 DNA(或 RNA)。但这确实意味着很多人只是按照说明操作,并不了解 DNA 提取试剂盒的工作原理。
 
为什么要了解核酸提取试剂盒的工作原理?
 
离心柱包含一种硅胶树脂,可根据盐条件和受提取方法影响的其他因素选择性地结合 DNA 和 RNA。这些 DNA 提取试剂盒使整个过程比旧的 DNA 分离方法更容易、更快。但是,使用套件的缺点是,如果您不了解套件的黑匣子中的内容,则会使故障排除变得更加困难。
因此,在本文中,我将详细解释 DNA 提取试剂盒的工作原理以及每一步的操作。
我还将讨论在 DNA 提取中使用硅胶柱的一些常见问题,只要稍微了解一下就可以克服或避免这些问题。

一、RNA和DNA提取:
裂解:裂解公式可能因您要提取 DNA 还是 RNA 而异,但共同点是含有高浓度离液盐的裂解缓冲液。
Chaotropes(离液剂)的作用:Chaotrope会破坏氢键及疏水间的相互作用。离液盐包括盐酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸锂。
洗涤剂:除了离液剂外,裂解缓冲液中通常还有一些去污剂,以帮助蛋白质溶解和裂解。
溶菌酶和蛋白酶K:根据样品类型,也可以使用酶进行裂解。蛋白酶 K 就是其中之一,实际上在这些变性缓冲液中效果较好;当蛋白质变性增多,蛋白酶 K 的作用也会相应增强。然而,溶菌酶在变性中不起作用,因此溶菌酶处理通常在添加变性盐之前进行。

二、关于质粒制备的注意事项
分离质粒 DNA 与提取 RNA 或基因组 DNA 的提取方式是不相同的,因为必须质粒与基因组 DNA 必须分离。如果此刻,您加入离液剂将立即释放所有物质,并且无法将小环状 DNA 与高分子量染色体区别开来。因此,在质粒制备过程中中,直到裂解后才加入离液剂,盐用于结合。
 
三、DNA 提取后纯化:将 DNA 与色谱柱结合
离液盐对于裂解至关重要,而且对于将 DNA(或 RNA)与色谱柱结合也是如此。此外,为了增强和影响核酸与二氧化硅的结合,还添加了酒精。
大多数情况下这是乙醇,但有时可能是异丙醇。乙醇百分比和体积有很大的影响。太多,你会带入大量降解的核酸和小物种,这会影响 A260 读数并降低你的一些产量。太少,可能难以从膜上洗掉所有盐分。
如果您在裂解中使用含有 SDS 的去污剂,请尝试使用NaCl 作为沉淀剂,以避免去污剂污染 DNA 或 RNA。

四、洗涤 DNA(或 RNA)
当裂解物通过硅胶膜进行离心分离,现在所提取的 DNA 或 RNA 应该与柱子结合,杂质、细胞蛋白和多糖应该已经通过了。 
但是,膜仍然被残留的细胞蛋白质和盐弄脏。如果样品来自植物,仍然会有多糖,也许一些色素留在膜上,或者如果样品是血液,膜可能会被染成棕色或黄色。

洗涤步骤用于去除这些杂质。
通常有两次洗涤,尽管这可能因样品类型而异。第一次洗涤通常会含有少量的离液盐,以去除蛋白质和有色污染物。这之后总是用乙醇洗涤以除去盐。
如果开始的准备工作没有大量蛋白质,例如质粒准备或 PCR 清理,则只需要乙醇洗涤。去除离液盐对于获得高产量和高纯度的 DNA 或 RNA 至关重要。一些试剂盒甚至会用乙醇清洗柱子两次。如果残留盐分,核酸的洗脱会很差,A230读数会很高,导致260/230的比率很低。对于无乙醇 DNA 和 RNA,需要进行干法离心,乙醇洗涤后,大多数方案都有一个离心步骤来干燥柱子。这是为了去除乙醇,对于清洁的洗脱液是必不可少的。 当将 10 mM Tris 缓冲液或水应用于膜进行洗脱时,核酸会水合并从膜中释放出来。如果色谱柱上仍有乙醇,则核酸无法完全再水合。如果跳过干燥步骤会导致乙醇污染和低产量。很可能在 Nanodrop 上看不到乙醇吸光度,所以它不会出现在您的读数中。
 
五、RNA 和 DNA 提取:洗脱
DNA 提取方案的还剩余IDE步骤步就是从硅胶中释放纯 DNA 或 RNA。
对于 DNA 制备,通常使用 pH 值为 8-9 的 10 mM Tris。DNA 在弱碱性 pH 值下更稳定,在缓冲液中溶解得更快。即使对于 DNA 颗粒也是如此。水的 pH 值往往较低,低至 4-5,并且高分子量 DNA 在用于洗脱的短时间内可能无法完全再水合。
通过在离心前让缓冲液在膜中停留几分钟,可以较大限度地洗脱 DNA。
由于RNA 易溶于水,且RNA 利于处在微酸性的 pH 值环境下。
 
 
六、RNA 和 DNA 提取实验中的问题
1.产量低
如果您遇到的 DNA/RNA 产量低于您对样品的预期,则需要考虑许多因素。通常,这是一个裂解问题。不完全裂解是产量低的主要原因。它也可能是由不正确的绑定条件引起的。确保使用新鲜的优质乙醇(100% 200 标准)稀释缓冲液或添加到结合的步骤。劣质乙醇或旧库存可能已经吸收了水分,并且浓度不正确。如果洗涤缓冲液制备不正确,您可能正在洗掉提取的 DNA 或 RNA。
2.低纯度
如果提取的 DNA 被蛋白质污染(低 260/280),那么您可能开始时样品过多,而蛋白质没有完全去除或溶解。
如果 DNA 的 260/230 比率不佳,则问题通常是结合或洗涤缓冲液中的盐分。确保使用最高质量的乙醇来制备洗涤缓冲液,如果问题仍然存在,请再次洗涤色谱柱。
与其他样品相比,一些样品含有更多的抑制剂。环境样品特别容易出现纯度问题,因为腐殖质在提取过程中会被溶解。
腐殖质的行为与 DNA 相似,很难从硅胶柱中去除。
3.降解
降解问题是RNA制备中常常到的问题。因为在 RNA 提取过程中,样品储存不当或裂解效率低等情况都会导致降解。对于 DNA 提取,降解不是一个大问题,因为对于 PCR,DNA 可以被剪切并且工作正常,如果不希望有较多剪切的 DNA,可以使用弱裂解的方法。
 
七、PCR 清理时的注意事项
 PCR 净化其实并不是 DNA 提取技术本身,但它是一种效率高且简单的技术,它只是添加高浓度的结合盐(通常每体积 PCR 反应 3-5 体积盐)和离心来过滤。
在实验过程中,PCR Clean-up 试剂盒出现故障也会导致整个实验功亏一篑。
因为在PCR 反应中有较多吸收 260 度紫外线的物质,比如:核苷酸、去污剂、盐和引物。所以,PCR 净化试剂盒经常无法正常工作可能是由于 PCR 反应失败所造一般成较难清理。


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来源:苏州阿尔法生物实验器材有限公司
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