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细胞计数杯的结构形态、使用原理与应用前景
点击次数:641 发布日期:2021-10-11  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
细胞计数杯是针对传统细胞计数方法存在的问题设计的。细胞计数的正确含义是检测细胞样本的细胞密度,即单位体内的细胞数,不是单纯计量细胞数。细胞密度由检测样本中细胞数和样本体积两个因素构成,两者都准确细胞密度才准确。目前有代表性的三类细胞计数仪都没有解决好细胞密度的问题。1.传统细胞计数板的问题是计数的细胞样本体积不准确。细胞计数板的计数池体积标定为1.0mm×1.0mm×0.1mm=0.1微升,深度不包括计数池与盖玻片之间的空隙,空隙大小不确定。实际计数样本是充满计数池与盖玻片之间的空间,所以计数体积不准。2.细胞计数仪,如Cellometer自动细胞计数仪。它是假定计数的显微镜视野相当于细胞计数板一个计数池的面积,没有考虑液体深度,而且显微镜放大或缩小视野面积会改变,所以计数样本体积更不准确。3.流式细胞计数仪,以B.Dtc20-automated-cell-counter 为例,是根据库尔特原理,以颗粒大小相当于细胞大小为判定标准计数细胞,非细胞颗粒会当成细胞计数,细胞在生长分裂过程中体积会有变化,过大与过小的细胞会漏计数,不同类型细胞体积可以一样大,所以细胞计数不准确。这三类细胞计数器还存在一个共同问题:计数的细胞样品不可以回收使用。这个细胞计数杯计数方法解决了传统细胞计数方法存在的问题。这个细胞计数杯还没有商品,希望有兴趣有能力的厂家生产出来,推广应用。

1. 细胞计数杯的结构形态
细胞计数杯是一个方形塑料杯,杯底内表面积(不含壁厚)4.0mm×4.0mm,杯口面积6.0mm×6.0mm,杯高10.0mm,体积160微升,图-2。杯底表面用横竖16×16条线分割成256个方格,标有纵横序列号,双线将方格分成16个计数区,虚线是边线,可以划线或不划线,图-1。4个计数杯一组连在一起,图-3。连体计数杯排列在铸有配套方孔的杯架上,随意取放,图-4。一个整体透明杯盖盖在连体计数杯与杯架上,图-5。图-5是实际应用形式,置于显微镜上计数细胞。整套杯具无菌处理,一次性使用。计数杯架4行8列,也可以做成4行4列。质量要点:(1)杯底和杯盖一定要完全透明,(2)杯底要平整,四周不能隆起或凹下,(3)杯底划线要均匀,方格不能有大有小。
 



2. 细胞计数杯的使用方法  
2.1. 基本使用方法
取10→100微升(任意选定)计数样品,轻轻放入计数杯中,将计数杯置于倒置显微镜平台上,待细胞完全沉入杯底后,按方格顺序计数细胞。每个方格里的细胞数不能密度太大,1~10较好。令记录到的总细胞数为C,样本体积为v,稀释倍数为f



 2.2. 快速统计学计数方法

计数256个方格内的细胞,需要5~10分钟时间,细胞密度大需要更长时间。在两种情况下可以选择用快速统计学方法计数。平均每个方格里的细胞数称为细胞均数,用μ表示,(1)μ大于8个,(2)μ小于3个。例如(1)的情况,μ=10,把2560个细胞放入计数杯里,平均每个格子里10个细胞,但不会每个格子里都是10个细胞,有的多于10个,有的少于10个,大多数接近于10个,属于正态分布。(2)的情况,μ=1,把256个细胞放入计数杯里,平均每个格子里1个细胞,但不会每个格子里都是1个细胞,有的0个,有的1个,或2个,或3个...,接近于0个和1个的较多,属于偏态分布。图1画出了μ小于8的几种情况。图1表明,μ大于5趋近于正态分布,μ大于8属于正态分布。

2.2.1正态分布情况计数方法
细胞计数时,如果每个方格里的细胞数多于10个,可以按正态分布计数细胞密度。随机在16个计数区里选择n(5095%)。

细胞密度=μ×256×1/v×f

2.2.2偏态分布情况计数方法
细胞计数时,如果每个方格里的细胞数少于3个,可以按偏态分布计数细胞密度。Poisson分布函数适合处理概率很低(P<<1)和样品个数很多n>>30的低频率偏态分布事件。Poisson分布函数如下式,
 

公式(1)里的符号用细胞计数术语表示,
x是每个方格内的细胞数,x= 0, 1, 2, 3 … 20
P(x)是一个方格内有x阳性细胞的概率。
e为自然对数的底e = 2.71828.
μ为平均一个方格内的细胞数, μ称为单位均数。

细胞计数,一个方格为一计数单位,计数的方格数为单位数,用n表示。用rx表示一个方格内有x细胞的方格数,方格内有x细胞的概率为
 

方格内有0细胞的概率为
 

偏态分布rx决定于μ值。μ一定,r0,r1,r2 ..., 与 P(0), P(1), P(2) ..., 就一定。反过来rx和P(X)一定,μ也就一定。选择用P(0)或P(1)或P(2)..., 来确定μ是一样的。用公式(1)计算的是P(X)理论值,用公式(2)计算的P(X)是实验值,两者等价。用公式(1)计算P(X)时,由于涉及到指数和排列组合运算,相当麻烦。如果选择x=0,P(X)=P(0),求解μ就非常简单,
P(0)为阴性单位概率,将x = 0, 代入(1) 式           
                                            

两边取自然对数,lnP(0) = -μ. (1) 式与(2)式等价,于是
 

(5)式表示:均数等于阴性概率的负对数。这表示只要有了P(0)由(5)式即可求出单位均数μ.有了n和r0,就有了P(0)和μ. 256×μ是总细胞数。

细胞密度=μ×256×1/v×f

这样,计数细胞变成了计数空格,计数空格比计数细胞容易的多例如μ=1,大约256个格中有256个细胞,由(5)式可以计算出空格r0=94。计数256个细胞至少需要5分钟,计数94个空格有1分钟就够了。

2.3.细胞计数杯是验证传统细胞计数方法可信度的实用工具
细胞计数杯计数方法有两大优势,(1)计数细胞量大,一般在500以上,大到3000,(2)计数细胞样本体积大,10~100微升是传统计数板计数样本体积0.1微升的100~1000倍。计数细胞数量越多,体积越大,计数越准确,所以细胞计数杯计数得到的细胞密度准确度很高,经过验证达到98%以上,其他细胞计数方法都达不到。因此可以用作细胞计数准确性比较的参照标准,验证传统细胞计数方法的准确度。验证方法就是用同一个细胞样本,用不同方法计数,然后比较结果

2.4细胞计数杯是验证统计学误差理论的实用工具
统计学是一门应用非常广泛的学科。误差分析理论是其应用基础,误差公式是用数学理论推导出来的,老师讲授,学生接受,很少有人用实验做验证,不是没有人想验证,主要是没有简单实用的验证工具和方法。一般实验方法,因为无法获得标准的真实值而无法验证。有了细胞计数杯,这个问题就解决了。统计学误差分析理论有两套系统:正态分布系统和偏态分布系统。

2.4.1正态分布误差分析公式
(1)样本抽样误差
标准差是表示一套变量离散程度的指标,均数和标准差结合起来说明变量的分布情况。总体标准差公式, 
 

式中σ-总体标准差,x-变量值, μ-总体均数,N-变量个数。
由于很难获得μ值,一般用样本标准差估计总体标准差。
样本标准差公式:
 

式中S-样本标准差,-样本均数, n-变量个数。(7)式运算比较麻烦,一般转换成下式计算,
 

(2)均数抽样误差
从同一个总体中随机抽取同样大小的样本,由于存在抽样误差,各样本均数不会相同。以样本均数做变量值计算样本均数变异情况的标准差,称为均数标准误。统计学理论表明,均数标准误()与总体标准差(σx)及样本大小(n)的关系如下,
 

实际上总体标准差(σ)很难得到,只能获得样本误差(S),一般用样本误差代替总体标准差(σ)求得均数标准误的估计值,
 

2.4.2偏态分布误差分析公式
处理偏态分布事件的公式主要有二项式分布和Poisson分布。以Poisson分布为例,Poisson分布如(1)式,其均数误差公式为,
 

样本均数标准误估计值为
 

2.4.3均数的可信限
从均数为μ,方差为σ2的正态分布总体中随机抽取n样本,则样本均数近似以总体均数为中心的正态分布。根据正态分布理论,样本均数()与总体均数(μ)有如下关系
 

2.5如何用细胞计数杯计数方法验证正态分布误差理论的正确性
2.5.1验证统计学处理的随机事件是否符合正态分布或偏态分布状态
方法是将细胞计数杯放置水平,轻轻放入细胞,使之慢慢沉降,随机分布在杯底。然后计数方格中的细胞,细胞数相同的归为一组,称为频数,最后按频数大小排序,画在二维坐标图上。根据频数排序和频数图,确定均数大于10的符不符合正态分布理论,均数小于3的符不符合偏态分布理论。

2.5.2验证统计学抽样误差理论的方法
举一个例子,调查中国家庭收入平均水平。不可能对全部家庭都做调查,可以在全国各省区随机分别抽取300户家庭,合计有10000个家庭。一个办法是收集每个家庭的收入,计算家庭收入平均值和离散状况(样本误差)。另一个办法是将10000个家庭随机分成100个或200个样本,计算样本均数,然后求解均数标准误。统计分析结果得到一个样本均数(,μ)和标准差(S,Sμ)和均数标准误估计值()。统计分析结果对不对?符不符合真实情况?可信度多大?本例因为拿不到总体均数μ值,没有参照标准作,说不清楚。只能认为理论公式正确,结果就正确。公式正不正确?需要实践证明,至今未见过实验证明。细胞计数杯计数方法,因为能够把计数杯里的细胞全部准确计数出来,可以拿到总体均数μ值,所以能够验证误差公式的正确性。方法是,先按2.4.1方法将每个方格中的细胞计数出来,计算总体均数μ值,然后用误差公式计算误差值,误差大小与样本数(n)有关系,应该计算不同样本数的误差值。最后将结果带入公式 (15),公式成立证明正确,否则不正确,进而确定什么情况下正确,什么情况下不正确。

验证统计学理论目的不只是证误,而是提供一个实证和感性认识,让学习者从理论和实践两方面认识统计学理论,加深对理论的理解,应用起来心里踏实。

3.细胞计数杯的应用前景
上述情况表明,细胞计数杯计数方法避免了传统细胞计数方法存在的问题,大大提高了细胞计数的准确性,对于细胞学研究和临床应用具有重要意义,其计数准确性和多用途优势使其具有广阔的应用前景,特别是对统计学理论的验证功能,开设统计学课程的大、中、专院校都需要这样的工具和方法。
 
 
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