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FluidFM BOT单细胞显微操作赋能CRISPR基因编辑取得重大突破
点击次数:242 发布日期:2021-4-7  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

Jennifer Rottenberger1, Paul Monnier2, Maria Milla2, Tobias Beyer2, Dario Ossola2, Justin S Antony1 and Markus Mezger1
1 University Children's Hospital, Department of Pediatrics I, Hematology and Oncology, University of Tübingen, Tübingen, Germany
2 Cytosurge AG, Saegereistrasse 25, 8152 Glattbrugg, Switzerland

 

生物制药和生物学研究以及生物制品的生产制造都依赖于基因修饰的细胞系,这些细胞系的基因被修饰,以诱导所需的表现型。随着CRISPR等基因编辑技术的发现和发展,多位点编辑的越来越引起了研究者的重视,但实际研究表明,整个实验进程是冗长而复杂的过程。近期,来自德国图宾根大学附属儿童医院的学者和来自瑞士Cytosurge公司工程师合作,通过FluidFM BOT技术手段,在不到三周的时间内完成了多基因敲除的单克隆细胞系。

FluidFM BOT助力CRISPR实现新突破

自CRISPR作为一种基因编辑技术被发现和发展以来,它已经彻底改变了许多生命科学的研究领域。它为科学家提供了一种高度通用的基因工程工具,已经应用于各种广泛的生物体。科学家们对多基因位点编辑的多重策略的兴趣也正在急剧的增加:多重gRNAs的使用可以大大的增强CRISPR的应用范围。如多位点基因编辑,基因失调,细胞凋亡等。

用传统技术手段包括转染等方法将多个gRNAs传递到细胞中极具挑战。除了由几次DNA双链断裂引起的DNA损伤反应外,细胞活力也可能因物理损伤和化合物进入细胞核所引起的毒性而大大降低。所有这些都极大地限制了CRISPR多位点编辑的潜力和效率。

FluidFM BOT技术独具专利,可将化合物直接的输送到任何细胞的细胞核中(图1)。因此,所有的试剂可以调整为最佳的配比剂量进行注射,这样的话就最大限度地提高了效率,降低了细胞所受的物理压力,同时也减少了脱靶效应。FluidFM BOT技术完全屏蔽了常规基因递送方法的障碍,甚至CRISPR RNP复合物可以与数十甚至数百种不同的gRNAs共同注射。此外,FluidFM BOT的注射物不依赖于待注射物本身的特性,对于难以转染的细胞(如原代细胞)或需要大量的基因插入和沉默时候更具独特优势。


图1:FluidFM BOT技术可以温和地操作单个细胞。

在传统的细胞系发展系统实验中,为了得到稳定转染的细胞系,候选细胞系在增殖过程中被反复评估。目前需要的时间是12到14周。相比之下,通过FluidFM BOT技术可以挑选一个BOT注射编辑过的单个细胞,并从中产生克隆体——从转染之日起直到克隆体被鉴定出来,不到三周的时间。大大提高了细胞系构建的时间。

FluidFM BOT技术进行多基因敲除构建细胞系

接下来,我们将展示了如何使用FluidFM BOT技术在不到三周的时间内生成单克隆多敲除细胞系(图2)。首先,通过FluidFM BOT技术将外源物注射到CHO细胞中,同时靶向几个不同基因的基因组位点,直接将gRNA/Cas9 RNP复合物导入细胞核。纳米注射后,记录每个转染细胞的位置,这样以便在注射24小时后使用FluidFM BOT探针进一步分离成功转染的细胞。然后将这些细胞扩展成单克隆细胞系。接下来对细胞进行测序,以确定基因编辑是否成功。
 


图2:FluidFM BOT技术进行细胞株开发流程:第1天,细胞经FluidFM BOT注射转染。第2天,选择成功转染的细胞,通过FluidFM BOT系统进一步进行单细胞分离。从第3天到第14天,分离的单细胞扩展成稳定的单克隆细胞系,并对其基因组进行分析。
 

第1天:FluidFM BOT单细胞注射转染

通过FluidFM BOT技术进行纳米注射,简单的点击鼠标即可完成对几十个CHO细胞的细胞核进行精准注射,以大约5个细胞/分钟的速度自动完成注射。荧光标记物与所有不同的gRNA/Cas9 RNP复合物共注射,以方便监测注射过程并识别最佳候选复合物(图3)。
 


图3:FluidFM BOT注射CRISPR/Cas9复合物和荧光标记物的CHO细胞的荧光图像。
 

第2天:FluidFM BOT进行单细胞分离和分选

FluidFM BOT对细胞进行了注射转染24小时后,使用集成FluidFM BIO系列操作软件(ARYA)可以再次精确的找到所有目标细胞。进而,进行FluidFM BOT进行单细胞分离和分选,将目标单细胞采用孔径为4 μm的FluidFM探针进行单分离,放入空的孔板中(图4)。从视觉角度可以完全确保细胞系的单克隆性。
 

图4:明场成像可以完全确保细胞系的单克隆性。
 

第3 - 14天:单克隆细胞的扩增和突变分析

分离后培养克隆,并在3天和6天后监测其生长情况(图5.1和5.2)。90%以上的分离细胞发育成一个细胞群落。转染后14天,收集克隆并对目标基因进行测序分析。50%的克隆在靶向位点上显示突变。

图5.1:分离3天后的12组CHO细胞集落。

图5.2:单克隆细胞群落生长6天后


结论
结果表明,通过FluidFM BOT技术对单个细胞进行注射,完成了多个gRNAs同时递送到选定的单个细胞中这一艰难的任务。采用FluidFM BOT技术方法进行的CRISPR细胞编辑技术,同时共注入几十种gRNAs所获得的细胞系可以进一步扩增。此外,我们在这里证明了FluidFM BOT技术的使用大大减少了多表型单克隆细胞系的开发时间,从数月减少到三周。

展望
FluidFM BOT技术为单细胞基因工程领域带来了全新的突破,有潜力解决科学家目前面临的一些艰巨的挑战,尤其是在他们需要快速和有效地开发单克隆细胞系时。传统的方法完全适用于最常见的细胞系和基因工程策略,但当处理不常见的、罕见的或脆弱的、和已知难以转染的原代细胞类型,或者需要复杂的实验设计——例如CRISPR多基因编辑时,传统的方案就非常受限制。在这些特殊情况下,FluidFM BOT技术可能是仅有的可用的解决方案。

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来源:Quantum量子科学仪器贸易(北京)有限公司
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