FlexStation3多功能酶标仪在鉴定阻断hERG通道化合物中的应用
简介
药物诱导的人类 hERG 离子通道阻滞与患者潜在的致死性室性快速心律失常的易感性有关。近年来，FDA 批准的一些药物由于对 hERG 的脱靶作用而退出市场。因此，在药物发现过程的早期阶段，迫切需要鉴定能够阻断 hERG 通道的化合物。在此，我们展示在 FlexStation 3 多功能酶标仪上，一种新的
钾离子通道检测试剂盒研究 hERG 化合物活性的用途。这种分析方法利用了铊离子 (Tl+ ) 的渗透性，通过钾离子通道进入胞质，然后被一种新型荧光指示剂检测到。7 种参照的 hERG阻滞剂在中等 通 量 细胞试 验中进 行检 测，并将 FLIPR TetraSystem 和 IonWorks Barracuda Plus Automated Patch Clamp System 收集的数据值进行比较。
优点
•细胞水平的钾离子通道活性的功能测定
•均相免洗特性可降低孔间差异并简化操作流程
•相比于非均质化实验，扩展了信号窗口
图 1 FLIPR 钾离子通道检测试剂盒的原理。
材料和方法
制备化合物
实验流程
剂。在起始的染料加样步骤，铊离子指示剂以乙氧基甲基酯(AM) 的形式通过被动扩散穿过细胞膜进入细胞内。细胞质的酯酶可切割 AM 酯并释放其活性荧光构型。此外，一种具有专利的掩蔽染料应用于细胞外以降低背景荧光。细胞被钾离子和铊离子的混合物或铊离子存在下的配体刺激，可以激活钾离子通道。荧光信号的增加表示铊离子流入细胞内，确切地说是通过钾通道流入，因此显示了钾离子通道功能性的活性 测 量。FLIPR Potassium Assay Explorer Kit (MolecularDevices Cat# R8222) 试剂盒包含铊离子敏感的染料，掩蔽染料用于均质化操作，200 mM 硫酸钾，50mM 硫酸铊，5x 无氯缓冲液，HBSS + 20 mM HEPES 缓冲液。此试剂盒支持 10 块96 孔或 384 孔板。实验流程如图 2。
制备化合物
化合物的疏水性质影响表观效力值，可能是由于与实验器具的非特异性结合。在这项研究中，化合物首先在 100% DMSO中稀释，然后在检测前立即与 HBSS + 20 mM HEPES 缓冲液一同转移至玻璃内衬的聚丙烯板中。
实验流程
人 hERG 离子通道基因Kv11.1稳定转染的CHO细胞，由ChanTest Corporation (Cleveland, OH) 公司提供。在实验前两天，以 25000 个细胞 / 孔的密度将细胞种在黑色透明底的 96 孔板中，加入含有选择抗生素的生长培养基并在 37℃和 5% CO2 环境下孵育。在实验前的 24 小时，将生长培养基换成含有四环素的诱导培养基。实验前的 4 小时，将细胞孵育温度从 37° C 切换到 28℃，以增强细胞膜上 hERG 离子通道的表达。微孔板细胞与染料一起在室温下避光孵育 1 小时。
药理学分析时，首先加入 hERG 通道阻滞化合物，室温孵育30 分钟。在 FlexStation 3 酶标 仪检 测时，添加先前优化过的刺激缓冲液至每个孔中。在 SoftMax Pro 软件中设置激发波长 485nm, 发 射 波长 538nm。每 列的信号采 集 大 约 120秒， 间 隔 1.52 秒。 为了 进 行 对 比，使 用 FluxOR Assay Kit(Life Technologies) 试剂盒，按其实验手册进行平行试验。数据分析在 SoftMax Pro 软件和 GraphPad Prism 软件中完成。
通 过确定刺激 hERG 通 道 所需的铊 和钾的最佳浓 度 进 行实验方法的开发。在微孔板中测试不同浓度组合的硫酸钾和硫酸铊的刺激缓冲液，铊离子和钾离子缓冲液使 用 1x 无氯 缓冲液稀释。硫酸铊和硫酸钾每摩尔有两倍量的阳离子，因此我们认为它们的阳离子浓度是各自浓度的 2 倍。检测时，将刺 激缓冲液加入孔中的细胞比较不同浓度组合的信号轨迹，以确定提供最大信号的最佳浓度组合。使用 FLIPR TetraSystem 得到的数据显示，能够刺激 hERG 并提供最大信号的最优或最终的铊离子浓度是 1 mM，钾离子浓度时 10 mM。
图 2 在 FlexStation 3 酶标仪上，FLIPR 钾离子通道检测试剂盒的工作流程。
图 3 在 IonWorks Barracuda System 上的电生理实验。将化合物以 3x 的浓度加入 1% DMSO 中，再在孔中与缓冲液混合，稀释至终浓度为 1x 的化合物于 0.33% DMSO。化合物孵育 5 分钟后，按如下电压操作，+40 mV 刺激一秒，随后一秒至 -50 mV，测量峰值尾电流。
图 4 阻 断 hERG通道活性的代表性化合物的浓度响应曲线。在FlexStation 3 酶标仪上收集得到数据。
图 5 FLIPR 钾离子通道检测试剂盒的结果与竞争者试剂盒相比较。
图 6 FLIPR 钾离子通道检测试剂盒的信号动态范围与竞争者试剂盒相比较。4 uM 特非那定作为阴性对照，刺激缓冲液作为阳性对照。FLIPR 钾离子通道检测试剂盒的 Z factor = 0.67，n = 8；竞争试剂盒的 Z factor = 0.43，n = 8。
可与如下的 Molecular Devices 产品兼容。
可与如下的 Molecular Devices 产品兼容。
表 1 FLIPR 钾离子通道检测试剂盒，在 FlexStation 3 酶标仪、FLIPRTetra System、IonWorks Barracuda System 三套系统上得到的 IC50值进行对比。
表 2 FLIPR 钾离子通道检测试剂盒与竞争试剂盒的 IC50 结果比较。
电生理
为了进 行比较，从 IonWorks Barracuda 全自动膜 片钳系统获得了同一组 hERG 通道阻断剂的 IC
50 值 ( 图 3 )。为了捕获化合物使用依赖性的效应，在化合物添加前后，施加 5 次 0.1Hz 的电压。hERG 尾电流在第五次扫描时的峰值振幅被用来测量该化合物的效应。
结果
在 FlexStation 3 酶标仪上使用 FLIPR 钾离子通道检测试剂盒鉴定七个已知的 hERG 通道阻滞剂。化合物的浓度响应曲线 如 图 4。 在 FLIPR Tetra System、IonWorks BarracudaSystem 两套系统上得到的 IC50值 进 行对比，如表 1 所示。这三种检测系统中的 IC50 值在半对数 (1/2log) 范围内有较好的相关性，化合物效价的排序保持不变。
另外，四 个化合物被用来评估基于铊离子的参照实验剂盒( FluxOR 钾离子通道实验)的性能( 图 5 )。除了西沙必 利 (cisapride) 之外，实验获得的IC50值都是相似的，如表 2 所示。 西沙必利通过FLIPR 钾离子通道检测试剂盒得到的IC50 值 更 接 近 于 FLIPR Tetra System、IonWorksBarracuda System 两套系 统 得到的 值。FLIPR 钾离子通道检测试剂盒提供的平均信号窗口约为 225% ( % 确定为基线 )明显高于 FluxOR 试剂盒的平均值 90%，每组 8 个样本。为了进行统计分析，能完全阻断 hERG 通道响应的 4uM 特非那定 (terfenadine) 作为阴性 对照，阳性 对照选 择引起 最 大的hERG 通道响应的刺激缓冲液。FLIPR 钾离子通道检测试剂盒获得的更高 Z 因子得益于更低的孔间变异性和更宽的信号窗口 ( 图 6 )。这可能是因为 FLIPR 钾离子通道检测试剂盒是一种真正的均质性检测实验，不需要清洗步骤或更换介质，因此具有更低的孔间变异性。
另外，四 个化合物被用来评估基于铊离子的参照实验剂盒( FluxOR 钾离子通道实验)的性能( 图 5 )。除了西沙必 利 (cisapride) 之外，实验获得的IC50值都是相似的，如表 2 所示。 西沙必利通过FLIPR 钾离子通道检测试剂盒得到的IC50 值 更 接 近 于 FLIPR Tetra System、IonWorksBarracuda System 两套系 统 得到的 值。FLIPR 钾离子通道检测试剂盒提供的平均信号窗口约为 225% ( % 确定为基线 )明显高于 FluxOR 试剂盒的平均值 90%，每组 8 个样本。为了进行统计分析，能完全阻断 hERG 通道响应的 4uM 特非那定 (terfenadine) 作为阴性 对照，阳性 对照选 择引起 最 大的hERG 通道响应的刺激缓冲液。FLIPR 钾离子通道检测试剂盒获得的更高 Z 因子得益于更低的孔间变异性和更宽的信号窗口 ( 图 6 )。这可能是因为 FLIPR 钾离子通道检测试剂盒是一种真正的均质性检测实验，不需要清洗步骤或更换介质，因此具有更低的孔间变异性。
结论
FLIPR 钾离子通道检测试剂盒使用均质化、无需清洗的操作方案来测量钾离子通道的功能活性。此研究中，我们使用一系列的参照的 hERG 阻滞剂来证明 FlexStation 3 酶标仪的获得的结果与使用 FLIPR Tetra System 和电生理方法产生的数据具有强烈的相关性。
另一组实验中，FLIPR 钾离子通道检测试剂盒相比于竞争试剂盒产品，显示了明显更大的试验窗口和更高的 Z 因子。改进的试验质量联合 FlexStation 3 多功能酶标仪的中等通量能力或者 FLIPR Tetra System 的高通量能力，能够在药物发现的早期过程为 hERG 的特征分析提供一个有力的平台。
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参考文献
1. Characterization of hERG channel blockers using the FLIPR Potassium Assay Kit, Application Note, 2015.
2. D. Rampe, et al, A mechanism for the proarrhythmic effects of cisapride (Propulsid): high affinity blockade of the human cardiac potassium channel HERG, FEBS Letters 1997; 417(1): 28-32.
3. Karen Cook, James L. Costantin, and Xin Jiang, Validation of the IonWorks Barracuda System for hERG Ion Channel Assay, Application Note, 2011
