人天冬氨酸转氨酶(AST)真核蛋白

一、核心基础参数
‌基本属性‌：该蛋白成熟体的表达区域多为26-310aa或Val51~Ser310，实际分子量约34~39.1kDa，等电点约8.9，性状多为冻干粉，内毒素水平<1.0EU/μg，常规产品纯度≥95%，部分高纯度产品可达97%以上。
‌储存条件‌：需避免反复冻融，2-8℃环境下可保存不超过1个月，-80℃条件下可稳定保存12个月，37℃孵育48小时无明显降解，稳定性良好。
二、核心生物活性
该蛋白具备DNA水解活性，可有效切割单链和双链DNA，生成3'-OH末端片段，能将染色质切割成核小体单元，参与细胞凋亡、坏死过程中的核小体间DNA断裂，还可抑制抗DNA自身免疫，协同降解中性粒细胞胞外陷阱（NET），防止血栓形成与炎症后器官损伤。
操作步骤：
一、实验前通用准备
1‌、试剂器材准备‌：提前准备好重组蛋白、对应缓冲液、酶标仪、37℃恒温箱、精密移液器等器材。
2‌、试剂平衡处理‌：所有试剂、待测样本从2-8℃取出，室温平衡至少30分钟，液体组分使用前充分摇匀。
‌3、工作液配制‌：按说明书将20×浓缩洗涤液用蒸馏水稀释为工作液，对标准品进行倍比稀释得到梯度浓度系列。
二、ELISA定量检测操作步骤
1、每孔加入100μL标准品或待测样本，37℃孵育2小时。
2、吸弃孔内液体，加入100μL配制好的检测试剂A，37℃孵育1小时。
3、吸弃液体后洗板3次，再加入100μL检测试剂B，37℃孵育1小时。
4、吸弃液体后洗板5次，加入90μL底物溶液，37℃避光孵育15-25分钟。
6、加入50μL终止液，立即用酶标仪在450nm波长下读取OD值，计算样本中蛋白浓度。
三、明胶降解法活性验证操作步骤
1、将0.1–1μg重组蛋白与2×SDS上样缓冲液按1:1混合，全程‌不加热‌避免酶失活。
2、上样至含0.1%明胶的SDS-PAGE凝胶，设置蛋白Marker和空白缓冲液对照，80V恒压电泳1.5-2小时至溴酚蓝迁移至底部。
3、取出凝胶置于含2.5% Triton X-100的缓冲液中，室温摇动洗涤2次，每次30分钟，去除SDS恢复酶活性。
4、将凝胶转移至反应缓冲液中，37℃孵育16–24小时，之后用考马斯亮蓝R-250染色1小时，脱色至背景清晰。
5、观察结果：降解区域呈透明条带，未降解区域呈蓝色，条带强度与酶活性成正比。
四、蛋白纯化操作步骤
1、诱导表达后的菌体裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清液准备上柱。
2、利用His标签的亲和特性进行柱上结合，用低浓度咪唑缓冲液洗去杂蛋白。
3、用250-500mM高浓度咪唑缓冲液洗脱，收集目的蛋白组分。
4、若为包涵体表达，需用尿素/盐酸胍变性后，通过梯度透析完成蛋白复性。
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