果胶酶测试盒微量法
商品属性:
| 产品货号 |
YLS-SH1103-1 |
产品规格 |
100管/48样 50管/24样 |
| 检测方法 |
微量法 |
产品用途 |
仅供科研实验 |
测定意义:
果胶酶(pectinase)是一类分解果胶质酶类的总称,包括原果胶酶,果胶酯酶,多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶四大类,广泛存在于植物果实和微生物中,主要用于食品、酿酒、环保、医药、纺织及日化用品行业。
测定原理:
果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸,具有还原性醛基,与DNS试剂反应生成红棕色物质,在540nm有特征吸收峰,测定540nm处吸光值变化可计算得果胶酶活性。
自备实验用品及仪器:
天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。
实验流程:
样本前处理
称取约 0.5g 组织样本,加入 1.5mL 提取液,冰浴匀浆。随后在 4℃、12000g 的条件下离心 10分钟,取全部上清液置于冰上待测。
2. 测定操作
将试剂一置于 37℃ 水浴锅中保温10分钟以上。
在试管中依次加入 1mL 上清液、25μL 试剂二和 4mL 试剂一,充分混匀。
用试剂三工作液(碱液)调节pH至 7.8(溶液呈粉红色)。
将试管置于 37℃ 恒温水浴中准确反应 60分钟。每隔20分钟用试剂三工作液调节一次pH,使其始终维持在7.8(粉红色),并记录下总共消耗的试剂三工作液体积 V (mL)。
3. 结果计算
果胶酯酶活性 (U/g 质量) = 1.25 × V × F
注:V为消耗试剂三工作液的体积(mL);F为稀释倍数。
测定与数据分析
仪器预热:酶标仪或分光光度计需提前预热(通常30分钟以上),以确保光源稳定,保证吸光度(OD值)读数的准确性。
及时读数:加入终止液终止反应后,颜色的稳定性有限(通常在15分钟内),应在规定时间内尽快测定各孔的OD值。
绘制标准曲线:每次实验都必须同时制作标准曲线(建议做复孔)。如果样本的OD值超出了标准曲线的线性范围(过高或过低),需用相应的稀释液对样本进行稀释后重新测定,最终计算时乘以相应的稀释倍数。
蛋白浓度校正:对于组织或细胞样本的酶活性检测,通常需要同步测定样本的总蛋白浓度(如使用BCA法),以便将酶活单位标准化为 U/mg prot,从而消除样本浓度差异带来的误差。
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注意事项
全程低温:酶活性对温度敏感,样本提取过程务必在冰上进行。提取后的上清液若不能立即测定,建议分装后于 -20℃ 或 -80℃ 冻存。
避光操作:Amplex Red法和ELISA法中的显色试剂对光敏感,操作和孵育过程中需注意避光。
预测定:正式测定前,建议先取 2-3 个预期差异较大的样本做预实验。如果吸光值或荧光值超出试剂盒的线性范围,需对样本进行适当稀释。
仪器匹配:钼蓝比色法使用普通玻璃比色皿或96孔板即可;Amplex Red荧光法必须使用96孔黑板以减少孔间荧光干扰;ELISA法必须使用酶标仪。
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