大鼠牙周膜干分离自牙周膜组织;牙周膜(牙周韧带、牙周间隙)是由致密结缔组织所构成。多数纤维排列成束,纤维的一端埋于牙骨质内,另一端则埋于牙槽窝骨壁里,使牙齿固位于牙槽窝内;牙周膜内有神经、血管、淋巴和上皮细胞等。成纤维细胞(Fibroblast)是疏松结缔组织的主要细胞成分,由胚胎时期的间充质细胞分化而来。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)来源于胚胎时期的中胚层组织,具有很强的自我复制和多向分化潜能,具有向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞及肌细胞等多种终末细胞定向分化的能力,运用 MSCs来修复软骨损伤具有很好的应用前景,目前已能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉等组织以及羊水、脐带、脐带血中分离和制备间充质干细胞。牙周膜干细胞参与了牙周组织的病变、修复及再生过程。现在,利用牙周膜干细胞建立体外模型,已经成为有关员研究牙周组织疾病的重要手段。
方法简介 实验室分离的大鼠牙周膜干采用胶原酶消化结合差速贴壁法制备而来,细胞总量约为5×10⁵cells/瓶。
质量检测 实验室分离的大鼠牙周膜干经CD44免疫荧光鉴定,纯度可达90%以上,且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
培养基:含FBS、EGF、bFGF、Penicillin、Streptomycin等
换液频率:每2-3天换液一次
生长特性:贴壁
细胞形态:成纤维细胞样
传代特性:可传3代左右
消化液:0.25%
培养条件:气相:空气,95%;CO2,5%
大鼠牙周膜干体外培养周期有限;建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养,以此保证该细胞的佳培养状态。
关键操作流程:
原代细胞的制备是整个实验成功的基础,其核心在于将组织分散成单个活细胞。
1. 组织取材与预处理
无菌操作:整个过程必须在超净台内严格无菌进行,所有器械和溶液都需灭菌。
快速处理:组织从生物体取出后应尽快处理,以维持细胞活力。若不能立即处理,需在4℃条件下短期保存。
清洗与剪切:用预冷的PBS或Hank's液反复冲洗组织,去除血污和杂物。然后用无菌眼科剪将组织剪成约1mm³的微小碎块。
2. 细胞分离方法
根据组织类型和研究目的,主要有以下三种分离策略:
分离方法 原理与适用组织 优点 缺点
酶消化法 利用酶(如胰蛋白酶、胶原酶)降解细胞间质,适用于肝、肾、皮肤、肿瘤等大多数实体组织。 细胞得率高,分离效果好,是最常用的方法。 酶可能对细胞造成损伤,需精确控制消化时间和温度。
组织块培养法 将组织块直接贴附于培养瓶,细胞从边缘自然迁出。适用于上皮、胚胎等细胞间质少的组织。 操作简单,对细胞损伤小,能较好保留细胞特性。 细胞迁出和增殖周期长,得率相对较低。
机械分散法 通过剪切、研磨、筛网过滤或吸管吹打等物理方式分散组织,适用于脑组织等柔软样本。 快速,避免了酶对细胞的潜在毒性。 细胞损伤大,得率和存活率低,易形成细胞团块。
常用酶简介
胰蛋白酶 (Trypsin):作用强,适用于细胞间质较少的软组织。其活性依赖不含钙、镁离子的环境。
胶原酶 (Collagenase):特异性水解胶原蛋白,对细胞损伤小,尤其适用于富含结缔组织的坚硬器官(如乳腺、骨、软骨)。
3. 细胞培养与观察
终止消化:酶消化后,需加入含血清的培养基来终止反应,因为血清中含有抑制胰蛋白酶活性的因子。
过滤与接种:通过细胞滤网过滤,去除未消化的组织块,离心收集细胞后用完全培养基重悬,接种到培养瓶中。
耐心观察:原代细胞生长通常较缓慢,可能需要24小时甚至更长时间才能在镜下观察到贴壁的细胞。
常见难点与解决方案:
原代培养常被称为“玄学”,主要因为以下痛点:
1. 细胞不贴壁或死亡率高
原因: 消化过度、物理损伤或“失巢凋亡”。
对策: 优化酶浓度和时间;在培养基中添加 ROCK抑制剂 或特定的贴壁因子(如层粘连蛋白、纤连蛋白)。
2. 杂细胞污染(主要是成纤维细胞)
现象: 成纤维细胞生长极快,会迅速淹没目的细胞(如上皮细胞)。
对策:
差速贴壁法: 利用成纤维细胞贴壁快(1-2小时)的特性,先让其在培养瓶贴壁,收集未贴壁的悬液(含目的细胞)进行培养。
抑制剂法: 使用阿糖胞苷或特定抗体清除杂细胞。
3. 批次差异大
原因: 供体年龄、健康状况、取材部位不同。
对策: 尽量使用同一批次冻存的细胞进行实验;或者在实验设计时增加生物学重复。
公司正在出售的产品:
| 细胞甘肽还原酶活性比色法定量检测试剂盒 |
肌动蛋白C1抗体 |
| 饮料D-苹果酸比色法定量检测试剂盒 |
磷酸二酯酶5A(Phosphodiesterase 5A) |
| 细菌色肉汤 |
端粒酶活性TRAP电泳分析试剂盒 |
| TEM电镜石蜡切片免疫组织化学HRP酶联DAB基础检测试剂盒 |
PE标记小鼠CD45.2单克隆抗体 |
| 冰冻切片组织CASPASE-8蛋白表达NBT显色光学显微镜检测试剂盒 |
蝮蛇蛇毒巴曲酶/类凝血酶抗体 |
| 细胞PKG激酶总活性定量检测试剂盒(A/B/C) |
周期素依赖性激酶5激活结合蛋白C53抗体 |
| 冰冻切片组织TNF ALPHA蛋白表达NBT显色光学显微镜检测试剂盒 |
炭疽菌抗体 |
| 细胞色素P450 17A1重组兔单克隆抗体 |
DPY19L4蛋白抗体 |
| 细胞可溶性总核蛋白制备试剂盒 |
钠/氢交换样结构域蛋白1抗体 |
| 乳酸杆菌(Lactobacillus)鉴定 |
蛋白激酶A调节亚基a1抗体 |
| 细胞RCT激酶活性定量检测试剂盒(A/B/C) |
大鼠牙周膜干细胞8号染色体开放阅读框37抗体 |
| 阳离子通道精子相关蛋白β亚基抗体 |
酪氨酸磷酸酶受体相互作用蛋白Liprin α1抗体 |
| 大鼠皮层神经元细胞 |
小鼠垂体细胞 |
| Human Articular Chondrocyte Cells |
Duck Embryo Hepatic Mesenchymal Stem Cells |