间接法(常用)
包被:试剂盒的微孔板预先包被了纯化的HPV特异性抗原,通常是HPV病毒样颗粒(VLPs),如HPV16、HPV18或HPV6/11型的L1衣壳蛋白。
一抗结合:向微孔中加入稀释后的待测样本(如血清或血浆)。如果样本中含有特异性的HPV IgG抗体,它会与固相上的抗原结合,形成“固相抗原-HPV IgG抗体”复合物。
二抗结合:洗涤后,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG抗体(二抗)。该二抗会特异性地与已结合的HPV IgG抗体结合,形成“固相抗原-HPV IgG抗体-酶标二抗”复合物。
显色与检测:再次洗涤并加入TMB底物溶液,HRP催化TMB显色(蓝色),加入终止液后变为黄色。颜色的深浅与样本中HPV IgG抗体的浓度呈正相关。最后,使用酶标仪在450nm波长下测定各孔的吸光度(OD值),通过与临界值(Cut-off)比较进行定性或定量分析。
主要产品性能参数
检测方法:间接法或双抗体夹心法
检测范围:定量检测范围因试剂盒而异,例如 0.049 - 0.370 IU/mL (针对HPV16)。
灵敏度:通常在 1.0 ng/mL 或更低级别,具体取决于试剂盒设计。
精密度:
批内变异系数(CV):通常小于 10%
批间变异系数(CV):通常小于 15%
该试剂盒适用于多种生物样本,主要包括:
血清
血浆(如EDTA、肝素抗凝)
细胞培养上清液
组织匀浆
细胞裂解液
ELISA试剂盒的显著优势
1. 极高的灵敏度与特异性
这是ELISA最核心的竞争力。
高灵敏度:得益于酶催化底物的信号放大作用,ELISA能检测到低浓度甚至皮克级(pg/mL)的目标分子。这对于检测血清中微量的细胞因子、激素或早期疾病标志物至关重要。
高特异性:特别是双抗体夹心法(最常用的方法),利用捕获抗体和检测抗体双重识别抗原的不同表位,极大降低了非特异性结合和交叉反应的风险,确保结果的准确性。
2. 高通量与高效率
批量处理:标准的ELISA板通常是96孔或384孔格式,非常适合同时处理大量样本(如大规模筛查)。
自动化兼容:操作流程标准化,极易与自动洗板机、酶标仪等设备配合,减少人为误差,显著提升实验效率。
3. 样本适用性广且无需复杂纯化
多样本类型:可以直接检测血清、血浆、尿液、细胞培养上清液、组织裂解液等多种复杂样本,通常不需要预先纯化抗原。
定量分析:通过标准曲线,可以精确计算样本中目标分子的浓度,提供定量的生物学数据。
4. 安全且成本相对可控
安全性:与放射免疫分析法(RIA)不同,ELISA使用酶标记而非放射性同位素,避免了辐射危害,试剂处理更安全。
设备门槛低:除了酶标仪外,不需要昂贵的大型精密仪器(如流式细胞仪或质谱仪),普通实验室即可开展。
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ELISA试剂盒实验

第一阶段:准备工作 (Pre-preparation)
试剂回温:从冰箱取出试剂盒,将所有试剂(包括浓缩洗涤液、标准品、样本等)在室温(20-25℃)下平衡至少 30分钟。
注意:如果浓缩洗涤液有结晶,需置于37℃水浴助溶并混匀。
标准品稀释:按照说明书要求,使用专用稀释液对标准品进行梯度稀释(通常做7-8个浓度点),现配现用。
样本处理:确保血清、血浆或细胞上清液澄清无沉淀(如有沉淀需再次离心)。
第二阶段:加样与孵育
加样:
在酶标板的对应孔中,分别加入 100 µL(具体体积看说明书)稀释好的标准品和待测样本。
设置空白孔(只加稀释液)。
建议:每个样本做2-3个复孔,数据更可靠。
孵育:
盖上封板膜,放入 37℃ 恒温箱孵育 1-2小时(或按说明书要求,如室温2小时)。
原理:让样本中的抗原与板上的捕获抗体结合。
第三阶段:洗板与检测抗体
洗板(关键步骤):
弃去孔内液体,每孔加满洗涤液(约300-350 µL),静置浸泡 30-60秒 后甩干。
重复洗涤 3-5次。最后一次需在吸水纸上用力拍干,确保无残留液体。
加检测抗体:
每孔加入 100 µL 稀释好的检测抗体工作液(生物素化抗体)。
盖上封板膜,37℃ 孵育 1小时。