该方法利用针对HABP蛋白不同抗原表位的特异性抗体进行捕获和检测,具体步骤如下:
包被(捕获):酶标板孔内预先包被了抗人HABP的特异性单克隆抗体(固相捕获抗体)。
结合(抗原-抗体反应):
往包被的微孔中依次加入标本(血清、血浆等)和生物素标记的检测抗体(抗人HABP抗体)。
标本中的HABP抗原会同时与固相抗体和生物素标记抗体结合,形成“固相抗体-HABP抗原-生物素标记抗体”的免疫复合物。
酶标结合:加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素(Streptavidin)。亲和素与生物素具有极高的亲和力,从而将酶连接到免疫复合物上。
洗涤:彻底洗涤微孔,去除未结合的游离成分。
显色反应:加入底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色。
终止与检测:加入终止液(酸),溶液颜色由蓝变为黄色。颜色的深浅与样品中HABP的浓度呈正相关。使用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算浓度。
产品属性
| 产品名称 |
人透明质酸结合蛋白(HABP)ELISA试剂盒 |
货号 |
LZ-E029079 |
| 英文名称 |
Human Hya]uronate binding protein,HABP ELISA Kit |
规格 |
48T/96T |
| 用途 |
仅供科研实验 |
品牌 |
联祖 |
主要产品性能参数
参数项目 典型数值/范围 说明
检测方法 双抗体夹心法 特异性强,灵敏度高
检测波长 450 nm 建议双波长检测(参考波长630nm)
灵敏度 < 15 pg/mL (或 < 0.05 ng/mL) 高灵敏度,满足微量蛋白检测
检测范围 31.2 - 2000 pg/mL (或 0.1-20 ng/mL) 覆盖生理及病理浓度范围
特异性 高 识别人天然及重组HABP,与其他基质蛋白无明显交叉反应
重复性 CV < 10% (板内), CV < 12% (板间) 变异系数通常控
ELISA试剂盒的局限性与缺点
1. 操作步骤繁琐,对操作要求高
流程长:典型的ELISA实验涉及加样、多次孵育、多次洗涤、显色、终止等步骤,耗时较长(通常需要3-5小时甚至过夜)。
洗涤关键:洗涤步骤至关重要,洗板不彻底会导致背景值过高(假阳性),洗板过度或干涸则影响灵敏度。这对操作人员的细心程度有一定要求。
2. 易受干扰与“钩状效应”
钩状效应 (Hook Effect):当样本中目标抗原浓度极高时,可能会饱和捕获抗体和检测抗体,导致信号反而下降,出现假阴性结果。这需要对高浓度样本进行稀释复测。
基质干扰:样本中的杂质(如溶血、脂血、类风湿因子等)可能会干扰抗原抗体结合,导致结果偏差。
交叉反应:虽然特异性较高,但如果抗体质量不佳,仍可能与结构相似的分子发生交叉反应。
3. 仅检测抗原含量,信息有限
ELISA只能告诉你“有多少”抗原,无法提供关于抗原的生物活性(是否具有功能)或结构完整性的信息。例如,变性的蛋白可能仍能被ELISA检测,但已失去生物活性。
4. 试剂成本与稳定性
试剂成本:高质量的抗体(尤其是配对良好的单抗)制备工艺复杂,导致试剂盒成本相对较高。
酶的不稳定性:酶标记物对温度和环境敏感,若保存不当容易失活,影响实验结果。
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注意事项
样本要求:溶血的标本会影响检测结果,不宜使用。待测样本应尽早检测,如需保存,应在-20℃或-80℃冷冻,并避免反复冻融。
试剂准备:使用前需将所有试剂置于室温(20-25℃)平衡。浓缩洗涤液若有晶体析出,需在37℃下加热至完全溶解后再稀释使用。
操作规范:
为避免交叉污染,添加每个标准品、样品和试剂时应更换移液器枪头。
底物显色液应呈无色或很浅的颜色,若已变蓝则不能使用。
洗板步骤对结果准确性至关重要,无论是手动还是自动洗板,都应确保洗涤充分,并避免微孔在温育过程中干燥。
任何反应试剂不能接触漂白溶剂或其散发的强烈气体。