人血清淀粉样蛋白A3(Serum Amyloid A3, SAA3)ELISA试剂盒是一种专门用于体外定量检测人源样本中SAA3蛋白浓度的科研工具。SAA3属于急性时相反应蛋白家族,虽然其在血浆中的基础表达水平较低,但在炎症、感染和组织损伤等病理状态下表达会显著上调。值得注意的是,SAA3主要被认为是一种脂肪组织分泌因子(Adipokine)和局部炎症介质,这使其在代谢综合征和慢性炎症研究中备受关注。
以下基于通用的双抗体夹心法原理,为您详解该试剂盒的使用与特性:
检测原理.
试剂盒采用双抗体夹心法(Sandwich ELISA):
包被: 酶标板微孔中预先包被了针对人SAA3的特异性捕获抗体。
结合: 向微孔中加入标准品或待测样本。样本中的SAA3抗原会与包被在板上的捕获抗体特异性结合。
孵育与洗涤: 温育后,洗去未结合的游离成分。
酶标: 加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体。该抗体将与已结合的SAA3抗原结合,形成“固相抗体-抗原-酶标抗体”的夹心复合物。
显色: 洗涤去除未结合的酶标抗体后,加入底物TMB。HRP催化TMB显色,溶液呈蓝色。
终止与测定: 加入终止液(通常为硫酸溶液)后,颜色由蓝变黄。在酶标仪450nm波长下测定各孔的吸光度(OD值)。样本中SAA3的浓度与OD值成正比,通过标准曲线即可计算出其具体含量。
试剂盒组成.
不同品牌的试剂盒组分可能略有差异,以下是常见的标准配置:
组分名称 描述 保存条件
酶标包被板 96孔(8×12条),已包被捕获抗体 2-8℃密封保存
标准品 重组人SAA3蛋白(通常为冻干粉) -20℃或4℃
酶标试剂 HRP标记的抗人SAA3抗体 2-8℃避光保存
样品稀释液 用于稀释待测样本 2-8℃
标准品稀释液 用于溶解和稀释标准品 2-8℃
浓缩洗涤液 20×或30×浓缩液(含吐温-20) 2-8℃
显色剂A液和B液 TMB底物溶液 2-8℃避光保存
终止液 2M H₂SO₄ 常温
样本要求与处理.
SAA3作为一种特殊的急性时相蛋白和脂肪因子,样本处理需格外注意:
样本类型: 血清、血浆(EDTA、肝素或柠檬酸钠抗凝)、细胞培养上清、组织匀浆等。
采集规范:
血清: 全血标本于室温放置2小时或4℃过夜,然后以1000×g离心20分钟,取上清。
血浆: 使用抗凝剂采集标本,采集后30分钟内于1000×g离心15分钟,取上清。
注意事项:
避免脂血: 由于SAA3与脂质代谢相关,高血脂样本可能会干扰检测,建议尽量避免。
避免溶血: 溶血会释放内源性酶类,可能干扰显色反应。
保存条件:
若不立即检测,应按一次使用量分装,冻存于-20℃(1个月内检测)或-80℃(6个月内检测),避免反复冻融。
典型性能参数.
检测范围(Detection Range): 不同品牌差异较大,常见范围如 0.156 ng/mL ~ 10 ng/mL 或更宽。
灵敏度(Sensitivity): 通常可检测到 < 50 pg/mL 的浓度。
特异性: 系统与人SAA1、SAA2及其他细胞因子(如CRP、IL-6)无交叉反应(注:SAA家族成员间可能存在一定交叉反应,具体视抗体特异性而定)。
有效期: 通常为6-12个月(具体视品牌和保存条件而定)。
操作步骤概览.
平衡: 试剂盒从冰箱取出,在室温(20-25℃)平衡15-30分钟。
配液: 将浓缩洗涤液按比例(如1:20)用蒸馏水稀释。
配制标准品: 将冻干标准品溶解并进行倍比稀释,得到一系列浓度的标准品。
加样: 在微孔板中分别加入标准品和待测样本(通常为50-100μL/孔)。
温育: 用封板膜封板,在37℃恒温箱中温育60-90分钟。
洗涤: 弃去孔内液体,用洗涤液洗板5次,并拍干。
加酶标: 加入酶标试剂,37℃温育30-60分钟。
再次洗涤: 重复步骤6。
显色: 加入TMB显色液,37℃避光显色10-15分钟。
终止: 加入终止液,轻轻震荡混匀。
读数: 在15分钟内使用酶标仪在450nm波长下测定OD值,计算浓度。
注意事项.
洗板质量: 洗板不彻底会导致背景过高,建议洗板后在吸水纸上拍干,且洗涤液注满微孔。
显色: 显色过程需避光,若溶液变蓝过快可能提示酶标试剂污染或失效。
安全: 终止液为强酸,操作时请佩戴手套和护目镜。所有样本均应视为潜在传染源处理。
准确性: 建议所有样本和标准品做复孔检测,以减少误差。"