人网膜素(Omentin)ELISA试剂盒是一种专门用于体外定量检测人血清、血浆、细胞培养上清及组织匀浆等生物样本中网膜素(Omentin/ITLN1)蛋白浓度的科研工具。
网膜素(主要指Omentin-1/ITLN1)是一种主要由网膜脂肪组织分泌的脂肪因子,在调节胰岛素敏感性、抗炎及心血管保护中发挥重要作用。其水平在肥胖、2型糖尿病及代谢综合征患者中往往显著降低。检测网膜素水平对于代谢性疾病及炎症相关机制的研究具有重要价值。
以下是对人网膜素(Omentin)ELISA试剂盒的详细解析:
1. 检测原理.
该试剂盒普遍采用双抗体夹心法(Sandwich ELISA):
包被:酶标板微孔中预先包被了抗人Omentin的特异性捕获抗体。
结合:加入标准品或待测样本后,样本中的Omentin抗原与固相载体上的捕获抗体特异性结合。
检测:洗涤后,加入酶标检测抗体(通常为HRP标记的抗人Omentin抗体,或生物素标记抗体+HRP-亲和素系统)。该抗体与已固定的抗原结合,形成“抗体-抗原-酶标抗体”夹心复合物。
显色:加入TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)底物显色液,HRP催化TMB产生蓝色,加入终止液(通常为硫酸溶液)后变为黄色。
测定:在酶标仪450nm波长下测定吸光度(OD值)。样本中Omentin的浓度与OD值呈正比,通过标准曲线计算出具体浓度。
样本处理与要求.
样本处理的规范性直接影响检测结果的准确性。
样本类型:
血清:使用无热原试管收集血液,室温静置2小时或4℃过夜,离心(1000 × g,20分钟)取上清。
血浆:可使用EDTA、肝素或柠檬酸钠作为抗凝剂。采集后30分钟内离心(1000 × g,15分钟)取上清。
组织匀浆:用预冷的PBS(0.01M, pH 7.0-7.2)冲洗去除血液,在冰上充分研磨,离心取上清。
细胞培养上清:离心(1000 × g,20分钟)去除细胞碎片后检测。
保存与禁忌:
避免反复冻融:样本若不立即检测,应按单次用量分装,冻存于-20℃(短期)或-80℃(长期)。
严禁:样本中绝对不能含有(),因为它会抑制HRP酶的活性。
标准操作流程 (SOP).
平衡:将试剂盒从冷藏环境(2-8℃)取出,在室温(20-25℃)下平衡15-30分钟。
配液:将浓缩洗涤液(如20×)用蒸馏水按说明书比例稀释备用。
加样:
标准品:按说明书进行梯度稀释(如0、0.312、0.625、1.25、2.5、5、10 ng/mL等)。
待测样本:通常需用样本稀释液进行预稀释(如稀释5倍)。
温育:每孔加入标准品或稀释后的样本,37℃温育60-90分钟。
洗涤:弃去孔内液体,注满洗涤液,静置30秒-1分钟,弃去液体并在吸水纸上拍干,重复5次。
加酶标试剂:每孔加入HRP标记的检测抗体工作液,37℃温育60分钟。
再次洗涤:重复步骤。
显色与终止:每孔加入TMB显色液,避光37℃显色15分钟;加入终止液50μL终止反应。
读数与计算:以空白孔调零,在450nm波长下测定OD值(需在15分钟内完成)。根据标准曲线计算样本浓度,并乘以稀释倍数。
4. 关键性能参数.
不同品牌试剂盒的参数差异较大,一般指标如下表所示:
性能指标 典型数值/描述
检测范围 0.312 - 20 ng/mL (部分品牌为0.156-10 ng/mL或1.56 pg/mL-100 pg/mL)
灵敏度 最低检测限通常 < 0.1 ng/mL (部分高敏试剂盒可达pg/mL级)
特异性 识别天然和重组人Omentin-1 (ITLN1),与其它脂肪因子无明显交叉反应
重复性 板内和板间变异系数(CV)通常 < 10%
保存条件 2-8℃避光保存,有效期通常为6个月
5. 临床与科研意义.
代谢综合征:网膜素是一种胰岛素增敏脂肪因子。其血清水平与胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)呈负相关,是肥胖和2型糖尿病的潜在保护因子。
心血管疾病:网膜素具有抗炎和保护血管内皮功能的作用,其水平降低与动脉粥样硬化、冠心病等心血管疾病风险增加相关。
炎症性疾病:研究网膜素在炎症性肠病(IBD)及慢性阻塞性肺疾病(COPD)中的调控作用。"