人丝状血球凝集素(Filamentous Hemagglutinin, FHA)ELISA试剂盒是一种用于体外定量检测人血清、血浆或细胞培养上清中百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)丝状血球凝集素蛋白浓度的科研工具。FHA是百日咳杆菌的关键毒力因子和保护性抗原,该试剂盒常用于百日咳感染的血清学诊断、疫苗免疫效果评价及免疫应答机制研究。
人FHA ELISA试剂盒通常采用双抗体夹心法(Sandwich ELISA)原理:
包被:将抗人FHA的特异性单克隆抗体预先包被在酶标板微孔中,制成固相载体。
加样:加入待测样本(如血清、细胞上清)或标准品。样本中的FHA抗原与固相抗体特异性结合。
孵育与洗涤:孵育后洗去未结合的杂质,形成固相抗体-抗原复合物。
加酶标抗体:加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗FHA多克隆抗体(检测抗体)。该抗体与已结合的FHA抗原结合,形成“包被抗体-FHA-酶标抗体”的夹心复合物。
显色与终止:加入TMB底物溶液,HRP催化底物显色(呈蓝色)。加入终止液后,溶液颜色由蓝色变为黄色。
测定:使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)。样本中FHA的浓度与OD值呈正比,通过标准曲线计算出其精确浓度。
主要组成.
不同品牌试剂盒的具体组分可能略有差异,以下是一个典型的配置示例:
组分名称 规格示例 (96孔) 主要用途
酶标包被板 96孔 (12条 × 8孔) 预包被抗FHA捕获抗体,用于捕获样本中的FHA。
FHA标准品 1-2瓶 (冻干粉) 用于配制标准曲线,浓度涵盖检测范围(如0-400 pg/mL)。
标准品/样本稀释液 1瓶 用于溶解标准品及稀释待测样本。
检测抗体-HRP 1瓶 辣根过氧化物酶标记的抗FHA抗体,用于催化显色。
显色剂 (TMB) A液、B液 显色底物,反应后呈蓝色。
终止液 1瓶 (硫酸) 终止反应,使溶液变黄。
浓缩洗涤液 1瓶 (20×/30×) 用于稀释后洗涤酶标板,去除非特异性结合物。
注意事项。
核心性能参数.
检测范围 (Sensitivity):不同品牌差异较大。例如,有的试剂盒检测范围为 6.25 - 400 pg/mL,灵敏度(最小可检测浓度)可达 3.9 pg/mL。
特异性 (Specificity):能够特异性识别人FHA,识别天然和重组FHA,与其它鲍特菌抗原(如PT、PRN)无明显交叉反应。
适用样本类型:适用于血清、血浆(EDTA、肝素抗凝)、细胞培养上清、鼻咽分泌物等。
精密度 (Precision):板内变异系数(CV%)通常小于10%,板间变异系数小于15%。
回收率:在不同样本基质(如血清、血浆)中的平均回收率通常在 85% - 110% 之间。
操作步骤概览.
准备:试剂盒从冷藏环境中取出,在室温(20-25℃)下平衡15-30分钟。将浓缩洗涤液按说明书比例(如1:20)用去离子水稀释。
加样:设置标准品孔和待测样品孔。在相应孔中加入50-100μL标准品或样本。
温育:用封板膜封板,置于37℃恒温箱中温育30-60分钟。
洗涤:弃去孔内液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,重复5次,最后拍干。
加酶标试剂:每孔加入检测抗体-HRP(空白孔除外),37℃温育30-60分钟,再次洗涤。
显色与终止:每孔加入TMB显色剂A、B各50μL,37℃避光显色10-15分钟,加入50μL终止液。
测定:以空白孔调零,在450 nm波长下测定各孔的OD值,并计算样本浓度。
注意事项.
样本处理:
血清:室温静置2小时或4℃过夜,离心取上清。-20℃或-80℃保存,避免反复冻融。
血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,采集后30分钟内离心取上清。
细胞上清:离心去除细胞碎片后取上清检测。
试剂使用:
洗涤液结晶:浓洗涤液低温下可能析出结晶,可65℃水浴溶解后使用,不影响效果。
底物避光:显色剂需避光保存,使用前现配现用。
禁止混用:不同批次的试剂盒组分严禁混用。"