人膜辅蛋白(MCP/CD46)ELISA试剂盒是一种用于体外定量检测人血清、血浆、组织匀浆等生物样本中可溶性CD46(sCD46)蛋白浓度的科研工具。
CD46(Membrane Cofactor Protein,膜辅蛋白)是一种广泛表达的补体调节蛋白,在防止自身细胞被补体系统攻击中起关键作用。以下我为你整理的详细操作与原理解析:
该试剂盒采用双抗体夹心法(Sandwich ELISA)。
包被: 酶标板微孔中预先包被了抗人CD46的特异性捕获抗体。
结合: 加入待测样本(或标准品)后,样本中的CD46抗原会与孔壁上的抗体结合。
检测: 加入酶标记(通常为HRP辣根过氧化物酶)的检测抗体,形成“固相抗体-抗原-酶标抗体”的夹心复合物。
显色: 洗涤去除未结合物质后,加入底物TMB。HRP酶催化TMB产生蓝色,加入终止液(通常为硫酸)后变为黄色。
定量: 颜色深浅与样本中CD46浓度呈正比,在酶标仪450nm波长下测定OD值,计算浓度。
主要组成成分.
组分名称 规格示例 (96T) 保存条件 主要用途
酶标板 96孔 (8孔×12条) 2-8℃ 预包被抗-CD46抗体。
标准品 0.3mL×6管 -20℃或2-8℃ 用于制作标准曲线(通常浓度梯度为48, 24, 12, 6, 3, 0 ng/mL或类似)。
酶标试剂 10mL×1瓶 2-8℃ HRP标记的抗-CD46抗体。
样本稀释液 6mL×1瓶 2-8℃ 稀释待测样本。
检测抗体稀释液 6mL×1瓶 2-8℃ 稀释酶标试剂(部分品牌需要)。
显色剂 A/B 各6mL×1瓶 2-8℃ (避光) TMB底物溶液。
终止液 6mL×1瓶 常温 2M 硫酸溶液,终止反应。
浓缩洗涤液 25mL×1瓶 (20×) 常温 使用前需用蒸馏水稀释。
标准操作流程 (SOP).
平衡与配液:
试剂盒从冰箱取出,在室温(18-25℃)平衡15-30分钟。
将20×浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍备用(如有结晶,可水浴溶解)。
标准品稀释:
按说明书进行倍比稀释(例如:48 → 24 → 12 → 6 → 3 → 0 ng/mL),制成标准曲线梯度。
加样:
标准孔:加入不同浓度的标准品(通常50-100μL)。
样本孔:加入待测样本(通常50-100μL)。
空白孔:不加样本,只加显色剂(作为空白对照)。
温育:
用封板膜封板,37℃温育60分钟。
洗板:
弃去孔内液体,吸水纸上拍干。
每孔注满洗涤液,静置1分钟,甩去洗涤液,拍干。重复5次。
加酶与洗板:
每孔加入酶标试剂(空白孔除外),37℃温育60分钟。
重复洗板步骤5次。
显色与终止:
每孔加入显色剂A和B各50μL,37℃避光显色15分钟。
每孔加入终止液50μL,轻轻震荡混匀,颜色由蓝变黄。
测定:
在15分钟内,使用酶标仪在450nm波长下测定各孔的OD值。"