本试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
操作流程:

实验前准备
试剂盒平衡:将试剂盒从冰箱取出,置于室温平衡20-30分钟,确保所有试剂恢复至室温。
组分核对:打开试剂盒,根据说明书核对组分是否完整(如酶标板、标准品、洗涤液、底物等)。
样本处理:若检测样本为血清或血浆,需4℃离心(1000g,5分钟)去除杂质。
标准品配制
溶解标准品:将冻干标准品离心后,加入指定体积的稀释液(如1mL),静置10分钟至完全溶解。
梯度稀释:准备7-8个EP管,每管加入稀释液(如250μL),从高浓度开始进行2倍稀释,最后一管为空白对照。
加样与孵育
加样:将标准品、样本及空白对照分别加入酶标板孔中(每孔100μL),注意更换枪头避免交叉污染。
孵育:覆膜后放入37℃恒温箱,孵育60-90分钟。
洗涤步骤
倒液拍干:孵育后甩尽孔内液体,每孔加入300-350μL洗涤液,浸泡30秒后倒出,重复洗涤3-5次。
拍干:在吸水纸上拍干板内残留液体。
操作步骤:

1.从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。
3.样本孔中加入待测样本50μL;空白孔不加。样本不足,或者样本浓度过高,可用样本稀释液做稀释。
4. 除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(350μL),静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
6. 每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。
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